In-vitro-Alternative zur Reaktogenitätsbewertung von Impfstoffen auf der Basis von Außenmembranvesikeln

Jan 19, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12675 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Intrinsische oder hinzugefügte immunaktivierende Moleküle sind für die meisten Impfstoffe von entscheidender Bedeutung, um die gewünschten Immunitätsprofile bereitzustellen, können jedoch die systemische Reaktogenität erhöhen. Aufsichtsbehörden verlangen einen Kaninchen-Pyrogentest (RPT) zum Nachweis der Reaktogenität des Impfstoffs. In letzter Zeit erfreut sich der Monozytenaktivierungstest (MAT) zunehmender Beliebtheit als In-vitro-Alternative, doch war dieser Test in erster Linie für die Prüfung pyrogenfreier Produkte konzipiert. Ziel war es, die MAT anzupassen, um die Prüfung pyrogenhaltiger Impfstoffe in einem frühen Entwicklungsstadium zu ermöglichen, in dem noch keine Referenzcharge verfügbar ist. MAT und RPT wurden zur Bewertung unbekannter Sicherheitsprofile von OMV-Impfstoffkandidaten (Pertussis Outer Membran Vesikel) mit denen von Bexsero als Ersatz-Referenzimpfstoff verglichen. Pertussis-OMVs mit Wildtyp-LPS aktivierten überwiegend TLR2 und TLR4 und waren reaktogener als Bexsero. Dieses Reaktogenitätsprofil für Pertussis-OMVs könnte jedoch im Vergleich zu Bexsero oder einem Ganzzell-Pertussis-Impfstoff durch Dosisänderung, Modifikation des LPS, intranasale Verabreichung oder eine Kombination davon ausgeglichen bzw. drastisch reduziert werden. Wichtig ist, dass mit Ausnahme der LPS-modifizierten Produkte die mit RPT und MAT erhaltenen Reaktogenitätsprofile vergleichbar waren. Insgesamt haben wir gezeigt, dass dieser Pertussis-OMV-Impfstoffkandidat ein akzeptables Sicherheitsprofil aufweist. Darüber hinaus bewies der MAT seine Anwendbarkeit zur Beurteilung der Reaktogenität von pyrogenhaltigen Impfstoffen in mehreren Phasen der Impfstoffentwicklung und könnte schließlich die Pyrogentests bei Kaninchen ersetzen.

Systemische Reaktogenität nach einer Impfung ist eine häufig beobachtete und überwachte Nebenwirkung. Die Reaktogenität wird durch pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) verursacht, die im Impfstoff vorhanden sind. Während einige Impfstoffe so konzipiert sind, dass sie völlig frei von PAMPs sind, um die systemische Reaktogenität zu minimieren, nutzen andere Impfstoffdesigns die adjuvierende Wirkung von intrinsischen oder zugesetzten PAMPs, um Immunantworten auf ein spezifisches Immunprofil zu lenken1. Äußere Membranvesikel (OMVs) sind kleine Partikel, die von der Außenmembran gramnegativer Bakterien abgegeben werden und daher intrinsische PAMPs wie Lipopolysaccharide (LPS) und Lipoproteine ​​enthalten2. In den letzten Jahrzehnten wurden OMVs in Impfstoffen implementiert, die gegen verschiedene Bakterienarten entwickelt wurden, wie z. B. Bordetella pertussis (B. pertussis), Neisseria meningitidis Serogruppe B (NmB), Neisseria gonorrhoeae (Ng) und Shigella3,4,5,6,7 . Darüber hinaus können OMVs als Träger und Adjuvans für Proteinimpfstoffe beispielsweise gegen Virusinfektionen wie SARS-CoV-28 eingesetzt werden. Die Zusammensetzung von PAMPs in OMVs und damit das Reaktogenitätsprofil können aufgrund ausgewählter Arten, Produktionsverfahren oder genetischer Veränderungen unterschiedlich sein9. Die Fähigkeit, die systemische Reaktogenität in einem frühen Stadium der Impfstoffentwicklung zu beurteilen, ist daher von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung pyrogenhaltiger Impfstoffe mit einem ausgewogenen Profil aus hoher Immunogenität und akzeptabler Reaktogenität.

Alle parenteralen Produkte, einschließlich OMV-Impfstoffe, müssen auf ihren Pyrogen-/Endotoxingehalt getestet werden, um ein akzeptables Sicherheitsprofil sicherzustellen. Derzeit gibt es mehrere Methoden zur Pyrogen-/Endotoxin-Testung. Der bakterielle Endotoxintest (BET) kann nur auf Endotoxine testen und würde daher andere in OMVs vorhandene Pyrogene, z. B. Lipoproteine, nicht nachweisen. Die andere Methode ist der Kaninchen-Pyrogentest (RPT), mit dem Endotoxin- und Nicht-Endotoxin-Pyrogene nachgewiesen werden können. Allerdings wird die RPT geändert, um inhärente pyrogene Impfstoffe zu analysieren (z. B. wird das Produkt vor der intravenösen Injektion verdünnt oder stattdessen intramuskulär injiziert)10. Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass der RPT weniger empfindlich auf Endotoxin reagieren kann als angenommen, was wahrscheinlich von der Art der verwendeten Kaninchenrasse und dem verwendeten Stamm abhängt11. Die neueste Methode zum Nachweis von Pyrogenen ist der Monozytenaktivierungstest (MAT), mit dem alle Pyrogene und nicht nur Endotoxine nachgewiesen werden können, wie dies beim BET der Fall ist. Darüber hinaus spiegelt die MAT das menschliche Immunsystem besser wider, da sie menschliche Monozyten anstelle von Monozyten des Kaninchenimmunsystems verwendet. Für parenterale Arzneimittel ist die MAT eine kompendiale Methode im Europäischen Arzneibuch (Ph. Eur.) und wird von der EU-Kommission als bevorzugte Ersatzmethode für die RPT angesehen, um dem 3R-Prinzip des Ersatzes, der Reduzierung und Verfeinerung sowie den Nachhaltigkeitszielen zu entsprechen12 .

Bei Impfstoffen, die intrinsische oder zugesetzte PAMPs enthalten, ist ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Sicherheit und Immunogenität erforderlich; Zu viel Reaktogenität führt zu mehr (schwereren) Nebenwirkungen und zu geringe Reaktogenität oder Stimulation führt zu einer verringerten oder fehlenden Wirksamkeit (Immunität). Der MAT kann zur Beurteilung dieses Grads der Reaktogenität verwendet werden und wird derzeit als Sicherheits- und Konsistenztest für Bexsero bei der Veröffentlichung verwendet13. Für die Prüfung von OMV-basierten Impfstoffen, die sich in der Entwicklungsphase befinden, musste die MAT optimiert werden, um die Reaktogenität dieser OMVs mit einem einzigen allgemeinen MAT-Verfahren beurteilen zu können. Diese Studie beschreibt die Ergebnisse des Optimierungsprozesses und des MAT-Tests mehrerer OMVs verschiedener Bakterienarten. Das verwendete MAT-Format war ein Vergleich der Referenzchargen, der mit der aktuellen Ph. Eur. übereinstimmt. Kapitel 2.6.30 (07/2017). Für einen Vergleich der Referenzchargen sollte eine bekannte und begründete Referenzcharge verwendet werden. Da sich unsere OMVs jedoch noch in der Entwicklungsphase befinden, ist die Angabe eines Referenzloses nicht einfach. Daher wurde Bexsero als Ersatz-Referenzimpfstoff ausgewählt, da dieser OMV-basierte Impfstoff ein anerkanntes Sicherheitsprofil aufweist und mit Bexsero gewonnene MAT-Daten in der Literatur verfügbar sind13,14,15. Schließlich wurden die unbekannten Sicherheitsprofile einer Auswahl von OMV-Keuchhusten-Impfstoffkandidaten entschlüsselt und im MAT und im RPT direkt verglichen, was zeigt, dass der MAT auch in dieser frühen Phase der Impfstoffentwicklung angewendet werden kann.

Alle OMVs wurden unter Verwendung eines bei Intravacc16 entwickelten verkleinerten Plattformproduktionsprozesses mit einer EDTA-Extraktionsmethode und einigen Optimierungsschritten je nach OMV-Typ und -Art hergestellt. Zwei Arten von OMVs gegen B. pertussis wurden einbezogen, entweder abgeleitet vom Stamm B1917 (der unmodifiziertes LPS enthält) (im Folgenden omvPV(WT LPS) genannt) oder einem Stamm mit einer LpxA-Modifikation im LPS17 (im Folgenden omvPV(LpxA) genannt). Einzelheiten zu den drei verschiedenen Produktionsverfahren, die zur Herstellung von omvPV(LPS) mit höherer Ausbeute und Reinheit eingesetzt wurden, konnten nicht bekannt gegeben werden. Der Meningokokken-OMV-Impfstoff wurde aus einem nicht eingekapselten Neisseria (N.) meningitidis Serogruppe B H44/76-Stamm mit einer Lpxl1-Modifikation18 (im Folgenden omvNmB(Lpxl1) genannt) isoliert. Der Neisseria gonorrhoeae-Stamm MS11 mit einer hinzugefügten Lpxl1-Modifikation wurde zur Herstellung des Gonokokken-OMV-Impfstoffs (im Folgenden omvNg(Lpxl1) genannt) verwendet. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mithilfe einer BCA-Methode (Micro BCA™ Protein Assay Kit, Thermo Fisher) bestimmt und diente als Standard-Impfstoffdosierung für alle OMVs, sofern nicht anders angegeben. Die standardmäßige Qualitätskontrolle von OMVs basierend auf Partikelgröße, Proteinzusammensetzung und LPS-Gehalt wurde wie zuvor beschrieben19 durchgeführt, es wurden jedoch keine Daten einbezogen. Die OMV-Struktur wurde zuvor mit TEM20 untersucht.

LPS wurde aus hitzeinaktiviertem B. pertussis-Lysat mithilfe einer Extraktionsmethode mit heißem Phenol und Wasser isoliert21. Die LPS-Konzentration wurde durch Analyse der Fettsäurezusammensetzung mit einer Gaschromatographie-Methode22 bestimmt. Zur Berechnung der LPS-Konzentrationen für WT-LPS bzw. LpxA wurde ein Molekulargewicht von 4057 g/mol bzw. 4001 g/mol verwendet.

Bexsero (GSK) und aPV (Daptacel DTaP, Sanofi Pasteur) wurden von der internationalen Apotheke bezogen. Der Ganzzell-Pertussis-Impfstoff (wPV) (Pertussis Vaccine (Whole Cell) WHO International Standard (94/532)23 wurde vom National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, England) bezogen.

Die MAT wurde mit dem MAT Cell Set (Sanquin Reagents, Amsterdam, Niederlande) durchgeführt, wobei die Anweisungen des Herstellers mit den beschriebenen Anpassungen befolgt wurden. Kurz gesagt, OMV-Präparate wurden in Vollmedium (Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Lonza, Verviers, Belgien) verdünnt, ergänzt mit entweder 5 % fötalem Rinderserum (FBS) oder 5 % Humanserum (HS) (beide von Biowest, Nuaillé, Frankreich) als Serumquelle) und 100 μl wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Jede Probenverdünnung wurde, wie in der jeweiligen Abbildung angegeben, in zweifacher, dreifacher oder vierfacher Ausführung getestet. Anschließend wurde ein Fläschchen mit 5 × 106 (± 1 × 106) kryokonservierten PBMCs (1 ml) in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut, bis ein kleiner Eisklumpen zurückblieb. Anschließend wurde die Zellsuspension in ein neues Röhrchen überführt und mit 10 ml Vollmedium verdünnt. In der MAT-Zellkulturplatte wurden 100 μl Zellen zu 100 μl Probe hinzugefügt. Anschließend wurde die 96-Well-Zellkulturplatte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 für eine Dauer von 18–24 Stunden mit etwa 45.000 Zellen/Well inkubiert. In dieser Studie wurden verschiedene Chargen kryokonservierter PBMCs (jeweils von 4 verschiedenen Spendern), HS- und OMV-Präparaten verwendet.

Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellkulturüberstände geerntet und in einer 1:5-Verdünnung auf das Vorhandensein von IL-6 analysiert, wobei ein kommerziell erhältliches ELISA-Kit (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (PeliKine Compact human IL-6 ELISA Kit, Sanquin, Amsterdam) verwendet wurde , Niederlande) kombiniert mit den zusätzlichen ELISA-Puffer und Reagenzien (PeliKine Toolset 1, Sanquin, Amsterdam, Niederlande) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dargestellt ist die optische Dichte (OD) bei 450 nm mit Abzug der Hintergrund-OD bei 550 nm.

Alle verwendeten Zelllinien wurden von Invivogen (Frankreich) bezogen. HEK-Blue hTLR2, HEK-Blue hTLR3, HEK-Blue hTLR4, HEK-Blue hTLR7, HEK-Blue hTLR9, HEK-Blue hNOD1, HEK-Blue hNOD2 sowie die Kontrollzelllinien HEK-Blue Null1 und HEK-Blue Null2 kultiviert (37 °C, 5 % CO2) in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) (Gibco), ergänzt mit 100 µg/ml Normicin (Invivogen), 100 Einheiten Penicillin, 100 Einheiten Streptomycin, 2,92 mg/ml L-Glutamin (Gibco) , 10 % hitzeinaktiviertes FBS (Gibco) und zelllinienspezifische selektive Antibiotika (Invivogen) in einem T75-Kolben. Als eine Konfluenz von 70–80 % erreicht war, wurden HEK-Blue-Zellen mit PBS (Gibco) aus den Kulturflaschen gelöst und subkultiviert. Als Durchgang 20 erreicht war, wurden die Zellen verworfen.

HEK-Blue-Zellen wurden in 96-Well-Platten (flacher Boden) mit 50.000 lebensfähigen Zellen in 100 µL Medium pro Well ausplattiert und über Nacht kultiviert (37 °C, 5 % CO2). Die Zellen wurden am nächsten Tag mit 100 µL OMVs beginnend bei 2 µg/ml in fünffachen Reihenverdünnungen und TLR/NOD-Antagonisten als Positivkontrollen stimuliert. Anschließend wurden die Platten 24 Stunden lang inkubiert (37 °C, 5 % CO2). Anschließend wurden 20 µL Kulturüberstand jeder Vertiefung in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen überführt, die 180 µL vorgewärmtes Quanti-Blue-Nachweisreagenz enthielt. Die Absorption wurde nach 1 Stunde bei 630 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Bio-Tek) abgelesen. Die TLR-Aktivierung wurde durch Berechnung der Faltungsänderung über die nicht stimulierten Zellen bestimmt.

50 gesunde weibliche Kaninchen (Outbred/New Zealand White) im Alter von 10–13 Wochen wurden in den Kaninchen-Pyrogentest einbezogen, der bei einem CRO (Charles River Laboratories Ireland Ltd., Irland) durchgeführt wurde. Der Studienplan wurde von der Ethikkommission der Charles River Laboratories Ireland Ltd. überprüft und genehmigt. Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie zum Schutz von für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tieren, Richtlinie 2010/63/EU, in der ins Irische umgesetzten Fassung durchgeführt Gesetz gemäß Statutory Instrument SI Nr. 543 von 2012 und ARRIVE-Richtlinien. Nach dreitägiger Akklimatisierung wurde jedem Tier unter Narkose (injizierbare Anästhesie in Form von Medetomidin (Medetor 1 mg/ml) mit 0,25 mg/kg und Ketamin (Narketan 100 mg/ml) mit 15 mg/kg chirurgisch ein Telemetrie-Temperaturchip implantiert und Meloxicam (Metacam 2 mg/ml) mit 1,0 mg/kg) in die Bauchhöhle (intraperitoneal). Die Grundtemperatur für jedes Kaninchen wurde über einen Zeitraum von 5 aufeinanderfolgenden Tagen (Studientag – 5 bis Studientag 0) bestimmt und musste innerhalb der normalen Grenzen (38–40 °C) liegen. Die Kaninchen wurden zufällig auf 10 Gruppen verteilt (n = 5 pro Gruppe) und zusammen in einem Käfig mit 5 Kaninchen pro Stall untergebracht. Am Studientag 0 wurden 7 Gruppen (35 Tiere) mit 0,5 ml (0,25 ml an zwei getrennten Stellen) des Testgegenstandes auf intramuskulärem Weg immunisiert. Gruppe 1: 50 µg omvPV(WT LPS), Gruppe 2: 10 µg omvPV(WT LPS), Gruppe 3: 50 µg omvPV(LpxA), Gruppe 4: 10 µg omvPV(LpxA), Gruppe 5: 1 Dosis Bexsero, Gruppe 6: 1 Dosis wPV oder Gruppe 7: Placebo. Zusätzlich wurden 3 Gruppen (15 Tiere) intranasal unter Narkose (wie oben beschrieben) mit 0,1 ml (0,05 ml pro Nasenloch) des Testgegenstandes immunisiert. Gruppe 8: 50 µg omvPV(WT LPS), Gruppe 9: 50 µg omvPV(LpxA) oder Gruppe 10: Placebo. Anschließend wurde die Temperatur aller 50 Kaninchen über einen Zeitraum von 30 Stunden überwacht. Gemäß ARRIVE wurden Tiere von der Studie ausgeschlossen, wenn sie nach der Operation oder infolge der Impfung inakzeptable Nebenwirkungen zeigten, z. B. sichtbare Anzeichen von Stress, Verweigerung von Futter und/oder Wasser oder Infektionen. Ein Tierarzt würde beurteilen, ob diese Tiere behandelt oder gegebenenfalls auf humane Weise eingeschläfert werden könnten. Insgesamt mussten keine Tiere oder Datenpunkte ausgeschlossen werden.

Die Anti-Pertussis-IgG-Antikörperspiegel in verschiedenen HS-Chargen wurden mithilfe eines Multiplex-Immunoassays wie zuvor beschrieben24 bestimmt. Insgesamt wurden die IgG-Antikörperspiegel gegen sechs gereinigte Pertussis-Antigene bestimmt, nämlich Bordetella-Resistenz gegen Abtötung (BrkA), Fimbrien 2/3 (Fim2/3), Filamentöses Hämagglutinin (FHA), Pertactin (Prn), Pertussis-Toxin (Ptx) und Virulenz assoziiertes Gen 8 (Vag8). Darüber hinaus wurden vom Stamm B1917 abgeleitete Vesikel der Außenmembran einbezogen, um ein breiteres Spektrum an Antigenen zu bestimmen, da diese Vesikel mehrere Pertussis-Antigene enthalten.

Mit GraphPad Prism 9.1.1 wurden die ODs gegen die Verdünnung aufgetragen, um die Daten grafisch darzustellen. zur Bestimmung der Fläche unter der Kurve (AUC) und zur Berechnung der p-Werte. Die AUC werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die p-Werte für MAT wurden mit dem Brown-Forsythe- und Welch-ANOVA-Test für Mehrfachvergleiche berechnet, der unterschiedliche SDs zwischen den Gruppen annimmt; da SDs von omvPV (WT LPS und LpxA) und Bexsero unterschiedlich waren. Die RPT-Daten wurden zum Mehrfachvergleich mit Standard-ANOVA analysiert.

Zur Optimierung des MAT wurde ein OMV-Impfstoff gegen B. pertussis (omvPV(WT LPS)) verwendet, der sich hinsichtlich Dosierung, Herstellungsprozess und Modifikation des LPS noch in der frühen Entwicklung befand. Basierend auf Immunogenitätsdaten bei Mäusen wurde eine geschätzte Dosierung von 100 µg/ml Gesamtproteingehalt im OMV als Anfangsdosis verwendet25. Bexsero (OMV-basierter Impfstoff gegen Neisseria meningitidis Serogruppe B (NmB)) wurde als Referenzprodukt verwendet, da sich der omvPV(WT LPS)-Impfstoff noch in der Entwicklung befand und daher noch keine Referenzcharge verfügbar war. Die in dieser Studie verwendeten PBMCs stammten aus einem kommerziellen Kit (MAT Cell Set). Dieses Kit enthält kryokonservierte gepoolte PBMCs von vier verschiedenen Spendern. Die PBMCs wurden vorab überprüft, um die Reaktivität gegenüber fünf verschiedenen Pyrogenen sicherzustellen, insbesondere HKSA (TLR 2) und FLA -ST (TLR5), PAM3CSK4 (TLR2/1), PGN (Nod2) und Endotoxin (TLR4).

Die auf PBMC basierende MAT erfordert die Zugabe von Serum zum Medium. Hierfür kann sowohl fötales Rinderserum (FBS) als auch Humanserum (HS) verwendet werden und beide wurden daher bei der Bewertung der Reaktogenität von omvPV(WT LPS) und Bexsero verglichen. Elf vierfache Verdünnungen von omvPV(WT LPS) und Bexsero wurden getestet, um den optimalsten Bereich und die optimale Serumquelle für die MAT zu ermitteln. Die getesteten Probenverdünnungen lagen im Bereich von 800x – 838.860.800x (entsprechend 1.600x – 1.677.721.600 × Verdünnung in der Vertiefung). Für omvPV (WT LPS) wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Werten der Fläche unter der Kurve (AUC) von FBS-basiertem und HS-basiertem MAT (p-Wert = 0,125) beobachtet (Abb. 1). Darüber hinaus war die beobachtete Reaktogenität von Bexsero auch zwischen FBS-basiertem und HS-basiertem MAT vergleichbar (p-Wert 0,306). Die Reaktogenität von omvPV(WT LPS) und Bexsero war sowohl bei FBS-basiertem als auch HS-basiertem MAT signifikant unterschiedlich (p < 0,05). Bexsero ist weniger reaktogen als die getestete Dosis von 100 µg/ml omvPV(WT LPS) (Abb. 1), da die IL-6-Reaktionen von Bexsero ab einer 3.200-fachen Verdünnung abzunehmen beginnen, während dies bei omvPV(WT LPS) ab einer Verdünnung der Fall ist Ab 819.200 ×. Insgesamt wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen dem FBS-basierten und dem HS-basierten MAT beobachtet. Daher wurde beschlossen, mit HS-basiertem MAT fortzufahren, da dieses das menschliche Immunsystem besser widerspiegelt und dem 3R-Prinzip entspricht.

Vergleich von HS und FBS in MAT. Die IL-6-Reaktionen wurden verglichen, als PBMCs mit unterschiedlichen Verdünnungen (Konzentrationen) von omvPV(WT LPS) und Bexsero stimuliert wurden, wobei entweder HS oder FBS als Serumquelle verwendet wurden, und werden als optische Dichte (OD, linke Grafik) und als Fläche unter der Fläche ausgedrückt Kurve (AUC) der OD-Kurven (rechte Grafik). Unverdünntes omvPV (WT LPS) enthielt 100 μg/ml OMV und Bexsero enthielt 50 μg/ml OMV. Nach einer Inkubation über Nacht wurde der IL-6-ELISA mit 1:5 verdünnten Kulturüberständen durchgeführt. Jede Probe wurde doppelt getestet. Die AUC der angepassten Kurven wird als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01.

Um die Robustheit des HS-basierten MAT zu bestimmen, wurden zwei zusätzliche HS-Chargen getestet. Diese Chargen zeigten vergleichbare IL-6-Reaktionen wie die Reaktionen, die mit der ersten HS-Charge (Charge 1; wie in Abb. 1) erhalten wurden (Abb. 2A). HS-Charge 2 ergab signifikant geringere IL-6-Antworten als Charge 1 oder 3 für omvPV(WT LPS) (p-Wert beträgt 0,018). Die Verwendung von HS im MAT könnte die tatsächliche Situation nach der Impfung beim Menschen besser widerspiegeln. Abhängig vom Antigen können jedoch frühere Impfungen und/oder natürliche Infektionen, die bei den Spendern aufgetreten sind, zum Vorhandensein von Antikörpern in der menschlichen Serumquelle führen, die die MAT-Ergebnisse beeinflussen können. Insbesondere für B. pertussis ist bekannt, dass die meisten Personen ein gewisses Maß und eine gewisse Diversität an Anti-Pertussis-Antikörpern aufweisen24, während das Vorhandensein von Anti-NmB-Antikörpern weniger wahrscheinlich ist (außer nach Bexsero-Immunisierung). Zu diesem Zweck beschlossen wir, das Vorhandensein verschiedener Anti-Pertussis-Antikörper in den drei HS-Chargen mithilfe einer verfügbaren Antigengruppe zu bestimmen (Abb. 2B). Erstens zeigten diese Ergebnisse, dass alle drei HS-Chargen tatsächlich Anti-Pertussis-Antikörper gegen alle getesteten Antigene enthielten. Zweitens wurde beobachtet, dass sich die Antikörperspiegel zwischen den drei Chargen unterschieden. Dies weist darauf hin, dass HS Anti-Pertussis-Antikörper enthält und dass jede Charge unterschiedlich ist.

Robustheit von HS-basiertem MAT mit omvPV(WT LPS) und Bexsero. Die Robustheit des HS-basierten MAT für omvPV (WT LPS) wurde mit verschiedenen Chargen von HS, PBMCs und Produktionsprozessen bewertet. (a) Die IL-6-Reaktionen wurden unter Verwendung von 3 verschiedenen HS-Chargen in Kombination mit PBMC-Charge Nr. A verglichen und als optische Dichte (OD) und als Fläche unter der Kurve (AUC) der OD-Kurven ausgedrückt. Jede Probe wurde im Duplo getestet. (b) Die Konzentrationen von Immunglobulin-G-Antikörpern (IgG), die gegen Ptx, Prn, FHA, Fim2/3, BrkA, Vag8 und OMV gerichtet sind, wurden in drei verschiedenen HS-Chargen bestimmt. Die Ergebnisse werden als Fluoreszenzintensitäten (FI) ausgedrückt. (c) Die IL-6-Reaktionen wurden unter Verwendung von 3 verschiedenen PBMC-Chargen in Kombination mit HS-Charge Nr. 1 verglichen. (d) Die IL-6-Reaktionen von drei verschiedenen Bexsero-Chargen wurden verglichen. (e) Die IL-6-Reaktionen von drei verschiedenen omvPV(WT LPS)-Produktionsprozessen wurden verglichen. Die Fläche unter der Kurve (AUC) der angepassten Kurven wurde bestimmt und als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, a – deutlich niedriger als der omvPV(WT LPS) der Charge 1, b – deutlich niedriger als der omvPV(WT LPS) der Charge 2, c – deutlich niedriger als der omvPV(WT LPS) der Charge 3.

Anschließend wurde die Robustheit des MAT untersucht, indem drei verschiedene Chargen kryokonservierter gepoolter PBMCs verglichen wurden. Jede Charge enthielt PBMCs von vier verschiedenen Spendern. Die IL-6-Reaktionskurven der beiden zusätzlichen PBMC-Chargen ähnelten denen von Charge A (Charge A; wie in Abb. 1) (Abb. 2C). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den PBMC-Chargen A, B und C innerhalb einer Probengruppe (Bexsero oder omvPV(WT LPS)), sondern nur signifikante Unterschiede zwischen den Probengruppen. Abschließend wurde die Sorte von drei Chargen des Referenzimpfstoffs Bexsero bestimmt. Dabei zeigte Charge 2 eine vergleichbare Reaktogenität wie Charge 1, während Charge 3 eine geringere Reaktogenität aufwies (Abb. 2D).

Zu diesem Zeitpunkt konnte keine Robustheitsprüfung an drei identischen Pertussis-OMV-Chargen durchgeführt werden, da die Optimierung des Produktionsprozesses noch im Gange war. Daher wurde alternativ der MAT-Assay verwendet, um omvPV-Produkte zu testen, die mit drei verschiedenen Produktionsprozessen erhalten wurden, die auf eine höhere OMV-Reinheit und -Ausbeute abzielten. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Produktionsprozess die Reaktogenität beeinflussen kann, da das omvPV aus Prozess 1 am reaktogensten war, während Prozess 3 zu der niedrigsten Reaktogenität führte (Abb. 2E), was darauf hindeutet, dass der MAT auch in dieser Phase der Impfstoffentwicklung verwendet werden kann.

Der entwickelte MAT wurde verwendet, um die Reaktogenität von OMV-Impfstoffen gegen verschiedene Bakterienarten zu testen und zu vergleichen, die sich in verschiedenen Entwicklungsstadien befinden (Abb. 3). Neben dem für die MAT-Optimierung verwendeten omvPV(WT LPS) wurden auch OMV-Impfstoffe gegen Neisseria meningitis Subklasse B (omvNmB(Lpxl1)) und Neisseria gonorrhoeae (omvNg(Lpxl1)) einbezogen. Beide wurden aus Stämmen mit einer modifizierten LPS-Struktur isoliert, um die Reaktogenität zu verringern. Für alle OMV-Impfstoffe wurden 100 µg/ml Protein als geschätzte Anfangsdosis verwendet. Dieses Experiment zeigte, dass omvPV(WT LPS) von allen diesen Produkten tatsächlich das höchste Reaktogenitätsprofil im MAT aufwies. Sowohl omvNmB(Lpxl1) als auch omvNg(Lpxl1) zeigten bei 100 µg/ml ein ähnliches oder sogar geringeres Reaktogenitätsprofil im Vergleich zu Bexsero. Bemerkenswerterweise war die Form der IL-6-Reaktionskurven für OMVs verschiedener Bakterienarten ähnlich, während die Zusammensetzung und Struktur der PAMPs zwischen den Arten unterschiedlich sein kann. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die optimierte MAT zum Testen mehrerer OMV-haltiger Impfstoffe anwendbar ist.

Reaktogenität gegenüber OMVs verschiedener Bakterienarten. Die IL-6-Reaktionen wurden für verschiedene Produktverdünnungen von omvNmB(Lpxl1), omvNg(Lpxl1) und omvPV(WT LPS) verglichen, die alle auf 100 μg/ml Protein eingestellt waren und als OD (linkes Diagramm) und AUC von ausgedrückt werden die OD-Kurven (rechte Grafik). Darüber hinaus wurde Bexsero in der menschlichen Dosis verwendet und diese enthielt 50 μg/ml OMVs (in 0,5 ml). Die AUC wird als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01.

Nach den ersten MAT-Optimierungsstudien wurde omvPV mit einem modifizierten LPS omvPV(LpxA) verfügbar. Daher konnte ein direkter Vergleich zwischen omvPV(WT LPS) und omvPV(LpxA) durchgeführt werden. Darüber hinaus haben wir beschlossen, LPS aus beiden Stämmen zu isolieren, um ausschließlich die Wirkung der LPS-Modifikation im MAT zu bestimmen. Durch die Dosierung der OMVs nach dem LPS-Gehalt statt nach der Proteinkonzentration könnte ein Vergleich mit dem gereinigten LPS durchgeführt werden, um den Beitrag von LPS zur Reaktogenität in den OMVs zu bewerten und um festzustellen, ob andere PAMPs möglicherweise eine Rolle spielen.

Die LpxA-Modifikation im LPS reduzierte deutlich die Reaktogenität der gereinigten LPS-Probe, da das LpxA-Isolat im Vergleich zum WT-LPS-Isolat eine geringere IL-6-Produktion induzierte (Abb. 4A). Die Form der IL-6-Reaktionskurve des WT-LPS-Isolats lässt jedoch darauf schließen, dass in der LPS-Zubereitung noch andere PAMPs vorhanden sind, da diese Kurve nicht wie für LPS erwartet eine Standard-S-Form aufwies. Dies könnte auf nicht pyrogenfreie Materialien zurückzuführen sein, die während des LPS-Isolierungsverfahrens verwendet wurden, oder darauf, dass einige Nicht-Endotoxin-Pyrogene (NEPs) aus B. pertussis zusammen mit LPS gereinigt wurden.

Beitrag von LPS und anderen PAMPs zur Reaktogenität von Pertussis-OMVs. (a) Die IL-6-Reaktionen von PBMCs wurden nach Stimulation mit OMVs und isolierten LPS der Stämme omvPV (WT LPS) und omvPV (LpxA) verglichen. 100 μg/ml WT-LPS und entgiftetes LPS (LpxA) wurden aus repräsentativen B. pertussis-Stämmen isoliert und mit omvPV(WT LPS) und omvPV(LpxA) verglichen, die eine Konzentration von 100 μg/ml LPS anstelle von 100 μg aufwiesen /ml Protein. (b) Die Aktivierung verschiedener PRRs durch Pertussis-OMVs wurde mit anderen Pertussis-Impfstoffen verglichen. Verschiedene Reporterzelllinien wurden mit omvPV(WT LPS), omvPV(LpxA), wPV oder aPV im Duplo stimuliert, wobei ein Verdünnungsbereich der Impfstoffe (2 – 0,000128 µg/ml) verwendet wurde. Die Fläche unter der Kurve wurde berechnet und als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.

Bemerkenswerterweise wurde der Effekt der LPS-Modifikation beim Vergleich von omvPV(WT LPS) und omvPV(LpxA) nicht beobachtet, da beide Produkte gleiche Reaktogenitätsprofile aufwiesen (Abb. 4A). Wichtig ist, dass die IL-6-Reaktion auf beide LPS-Isolate bei gleichen LPS-Konzentrationen geringer war als auf die beiden omvPV-Präparate, was darauf hindeutet, dass die durch beide omvPV verursachte Reaktogenität nicht ausschließlich auf die Anwesenheit von LPS zurückzuführen ist. Daher deuten diese Daten darauf hin, dass die omvPV-Präparate neben LPS noch andere NEPs der Bakterien enthalten, die zur Reaktogenität im HS-basierten MAT beitragen.

Um festzustellen, welche anderen PAMPs in den omvPVs vorhanden waren, testeten wir die Aktivierung einzelner Pathogenerkennungsrezeptoren (PRRs) unter Verwendung menschlicher Reporterzelllinien unter Verwendung von wPV und aPV als Kontrolle (Abb. 4B und ergänzende Abbildung 1). Erstens bestätigten diese Experimente, dass die LpxA-Modifikation im omvPV (LpxA) zu einer abgetragenen TLR4-Aktivierung führte, die mit dem durch aPV induzierten Niveau vergleichbar war. Die TRL4-Aktivierung wurde nach Stimulation mit omvPV(WT LPS) oder wPV in einem ähnlichen Ausmaß beobachtet. Die TLR2-Aktivierung war nach der Stimulation sowohl mit OMV-Impfstoffen als auch mit wPV bemerkenswert hoch. Darüber hinaus war die TLR2-Aktivierung durch omvPV(LpxA) im Vergleich zu omvPV(WT LPS) und wPV höher. Wie erwartet wurde nach der aPV-Stimulation keine TLR2- oder 4-Aktivierung beobachtet. Die anderen getesteten PPRs (TLR3, TLR7, TLR9, NOD1 und NOD2) wurden durch keinen der Impfstoffe aktiviert, mit Ausnahme einer geringfügigen NOD2-Aktivierung durch wPV. Insgesamt können wir den Schluss ziehen, dass die Pertussis-OMVs und wPV aufgrund des Lipoproteingehalts neben der TRL4-Aktivierung durch LPS eine TLR2-Aktivierung verursachen. Die TLR2-Aktivierung durch omvPV scheint sogar die einzige verbleibende PRR-Aktivierung der getesteten PRRs zu sein, wenn die TLR4-Aktivierung entfernt wird.

Abschließend wurden die beiden omvPV-Varianten in unterschiedlichen Dosen mit verschiedenen Referenzimpfstoffen (Bexsero und wPV) verglichen, wobei sowohl der MAT als auch der RPT verwendet wurden, um Unterschiede in den Spezies (Mensch vs. Kaninchen) sowie In-vivo- und In-vitro-Ergebnisse zu überbrücken. Für MAT und RPT wurden die gleichen Proben verwendet. Im MAT wurden Anfangskonzentrationen von 100 µg/ml oder 20 µg/ml Gesamtprotein für omvPV(WT LPS) und omvPV(LpxA) verwendet, während im RPT 0,5 ml dieser Lösungen intramuskulär (im) injiziert wurden, was zu einer Dosis führte von 50 µg bzw. 10 µg pro Kaninchen.

Zunächst wurde im MAT die In-vitro-Pyrogenität bestimmt. Hier wurde die Induktion von IL-6 in zwei verschiedenen Konzentrationen (100 oder 20 µg/ml) von omvPV(LpxA) und omvPV(WT LPS) mit der durch Placebo (NaCl), wPV (WHO-Standard) und induzierten Induktion verglichen Bexsero (Abb. 5A). Die Ergebnisse zeigten, dass alle Impfstoffe im Vergleich zu Kochsalzlösung mehr IL-6 induzierten. Das wPV induzierte den höchsten IL-6-Spiegel. Die Konzentrationen von 100 µg/ml sowohl von omvPV(LpxA) als auch von omvPV(WT LPS) waren im Vergleich zu wPV weniger pyrogen, im Vergleich zu Bexsero jedoch stärker pyrogen. Die Konzentrationen von 20 µg/ml sowohl von omvPV(LpxA) als auch von omvPV(WT LPS) waren im Vergleich zu Bexsero weniger pyrogen. Bemerkenswerterweise schien omvPV(WT LPS) im Vergleich zu omvPV(LpxA) für beide Dosen weniger pyrogen zu sein, obwohl dies auch im früheren Experiment beobachtet wurde.

Vergleich der Pyrogenität von Pertussis-OMVs nach LPS-Modifikation oder Änderung der Dosierung in MAT und RPT. (a) Vergleich zweier unterschiedlicher Dosen (Dosis 1 = 50 µg, Dosis 2 = 10 µg) von omvPV(LpxA) und omvPV(WT LPS) mit Placebo (NaCl), wPV (WHO-Standard) und Bexsero in MAT. Ergebnisse, die die IL-6-Konzentration darstellen, werden entweder als OD 450–550 nm in einem Verdünnungsbereich oder als AUC pro Gruppe mit SD dargestellt. (b) Temperaturschwankungen bei Kaninchen, stündlich gemessen über einen Zeitraum von 30 Stunden nach der Immunisierung, im Vergleich zur Temperatur vor der Immunisierung. (c) Die Fläche unter der Kurve (AUC) von t = 0 (Immunisierung) bis 30 Stunden nach der Immunisierung wurde berechnet. *Deutlich höher als die Kochsalzlösungskontrolle; a – deutlich niedriger im Vergleich zu 50 µg omvPV(WT LPS); b – deutlich niedriger im Vergleich zu 10 µg omvPV(WT LPS); c – deutlich niedriger im Vergleich zu wPV. Für jede Gruppe werden der Mittelwert und die Standardabweichung sowie Daten von jedem einzelnen Kaninchen (N = 5 pro Gruppe) dargestellt. (d) Korrelation zwischen MAT und RPT. Die AUC-Ergebnisse des MAT wurden gegen die AUC-Ergebnisse des RPT (nur bei intramuskulärer Verabreichung) aufgetragen. Die verschiedenen Gruppen werden als omvPV(WT LPS), omvPV(LpxA), Bexsero und wPV, Kochsalzlösung einschließlich einer Regressionslinie mit R = 0,75 und R2 = 0,56 dargestellt.

Zweitens wurde für die Pyrogenitätsstudie am Kaninchen ein ähnlicher Versuchsaufbau wie im MAT gewählt. Kaninchen erhielten 50 oder 10 µg omvPV(WT LPS) oder omvPV(LpxA) im und die Körpertemperatur wurde mit der von mit Placebo (NaCl), wPV und Bexsero behandelten Kaninchen verglichen. Die Körpertemperatur nach der Immunisierung wurde um die in den 5 Tagen vor der Immunisierung gemessene Basaltemperatur korrigiert. Anschließend wurden die Temperaturschwankungen über einen Zeitraum von 30 Stunden überwacht (Abb. 5B), der maximale Anstieg der Körpertemperatur nach der Immunisierung bestimmt (ergänzende Abbildung 2) und jeweils die AUC der korrigierten Körpertemperatur nach der Immunisierung berechnet Kaninchen (Abb. 5C).

Wichtig ist, dass die intravenöse Verabreichung von omvPV(LpxA) sowohl mit der 50-µg- als auch mit der 10-µg-Dosis zu einem signifikant geringeren Anstieg der maximalen Körpertemperatur und einer geringeren AUC im Vergleich zu omvPV(WT LPS) führte (Abb. 5C und ergänzende Abbildung 2). weist darauf hin, dass die LPS-Modifikation zu einem sichereren Reaktogenitätsprofil für das omvPV bei Kaninchen führt. Beim Vergleich von 50 µg omvPV(LpxA) mit 10 µg omvPV(LpxA) wurde ein Dosis-Wirkungs-Effekt beobachtet. Die niedrige Dosis führte zu einem deutlich geringeren Anstieg der maximalen Körpertemperatur (p = 0,003) und der AUC (p < 0,001). Darüber hinaus war die AUC nach einer Immunisierung mit 50 µg oder 10 µg omvPV(LpxA) im Vergleich zur wPV-Immunisierung niedriger. Der maximale Anstieg der Körpertemperatur unterschied sich jedoch nicht zwischen der 50-µg-Dosis und dem wPV. Darüber hinaus waren sowohl der maximale Temperaturanstieg als auch die AUC bei 50 µg omvPV(LpxA) höher als bei der Verabreichung von im Kochsalzlösung. Bemerkenswerterweise unterschied sich die 10 µg omvPV(LpxA)-Dosis hinsichtlich des maximalen Temperaturanstiegs und der AUC nicht von der Kochsalzlösungsgruppe.

Bei omvPV (WT LPS) führten sowohl die hohe als auch die niedrige Dosis im Vergleich zur Kochsalzlösungsgruppe zu einem höheren maximalen Anstieg der Körpertemperatur und einer größeren AUC (Abb. 5B, C und ergänzende Abbildung 2). Beim Vergleich der Wirkung der 50 µg-Dosis und der 10 µg omvPV(WT LPS) führte die niedrige Dosis zu einem deutlich geringeren Anstieg der maximalen Körpertemperatur (p = 0,02) und der AUC (p < 0,001). Der Vergleich von 50 µg im omvPV(WT LPS) mit wPV zeigte, dass beide Impfstoffe einen ähnlichen maximalen Anstieg der Körpertemperatur hervorriefen, die AUC jedoch nach der omvPV(WT LPS)-Immunisierung höher war. Auch ein vergleichbarer maximaler Anstieg der Körpertemperatur wurde nach Verabreichung von 10 µg omvPV(WT LPS) festgestellt, allerdings war bei dieser Dosis die AUC von omvPV(WT LPS) im Vergleich zu wPV niedriger. Schließlich führte Bexsero zu einem leichten Anstieg der maximalen Körpertemperatur, die AUC unterschied sich jedoch nicht wesentlich von der Kochsalzlösungskontrolle. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass beide Dosen von omvPV(WT LPS) und wPV sowie die 50-µg-Dosis von omvPV(LpxA) im Vergleich zu Bexsero bei intramuskulärer Verabreichung bei Kaninchen einen stärkeren Anstieg der Körpertemperatur (sowohl im maximalen Anstieg als auch in der AUC) hervorriefen.

Neben der intramuskulären Immunisierung haben wir auch die intranasale (In-)Verabreichung für beide omvPV untersucht, da wir zuvor gezeigt haben, dass dieser Immunisierungsweg im Vergleich zur systemischen Immunisierung mit Pertussis-OMVs noch vielversprechendere immunogene und schützende Profile liefert26. Bemerkenswerterweise wurde nach der intranasalen Immunisierung im Gegensatz zur Immunisierung weder ein Temperaturanstieg noch Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet (Abb. 5B, C und ergänzende Abbildung 2). Bemerkenswert ist, dass die Temperatur etwa in den ersten 10 Stunden gesunken war, was auf die Narkose zurückzuführen sein könnte, die nur bei der Verabreichung angewendet wurde (Abb. 5B). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass es möglich ist, mit dem omvPV ein gewünschtes Sicherheitsprofil bei Kaninchen zu erreichen. Für die intramuskuläre Immunisierung sind die LPS-Modifikation und eine niedrigere Dosierung erforderlich, während der intranasale Weg eine höhere Dosierung ermöglichen kann und/oder keine LPS-Modifikation erfordert.

Schließlich wurde die Korrelation zwischen den AUC-Ergebnissen von MAT und RPT (im Verabreichung) ermittelt, da in beiden Tests die gleichen Produkte getestet wurden. Die Korrelationsanalyse zeigte eine positive Korrelation (r = 0,75, p-Wert = 0,05) zwischen der AUC des MAT und der AUC des RPT (Abb. 5D). Wenn außerdem die Abnahme der Temperatur und der MAT-Reaktogenität zwischen 100 und 20 µg/ml (entsprechend 50 und 10 µg/Kaninchen) für omvPV(WT LPS) und omvPV(LpxA) verglichen wird, scheinen die Abnahmen parallel zueinander zu verlaufen Dies bestätigt eine gute Korrelation zwischen MAT- und RPT-Ergebnissen für verschiedene omvPVs. Insgesamt zeigt dies, dass die In-vitro- und In-vivo-Testergebnisse vergleichbar waren und dass der MAT als In-vitro-Alternative zur Beurteilung der Reaktogenität von OMV-basierten Impfstoffen dienen kann.

Diese Studie zeigte, dass der MAT robust ist und zur Bestimmung der Reaktogenität in verschiedenen OMV-basierten Präparaten verwendet werden kann, selbst solchen, die sich noch in der Entwicklungsphase befinden. Bei der in dieser Studie verwendeten MAT-Methode handelt es sich um eine Vergleichsmethode für Referenzchargen, die gemäß Ph. Eur. die bevorzugte Methode für inhärente pyrogene Produkte ist. Kapitel 2.6.30. Da für Impfstoffe in der frühen Entwicklung jedoch in der Regel keine Referenzcharge verfügbar ist, wurde beschlossen, Bexsero als Referenzcharge zu verwenden. Bexsero ist ein Mehrkomponenten-OMV-haltiger Impfstoff mit einem nachgewiesenen Sicherheitsprofil und es ist ausreichend Literatur zu MAT und Bexsero verfügbar13,14,15. Die in dieser Studie gefundenen Ergebnisse für Bexsero stimmten mit den von Valentini et al. berichteten Daten überein. obwohl es Unterschiede im verwendeten MAT-Format gab; Die mit unseren kryokonservierten gepoolten PBMCs erhaltenen IL-6-Kurven begannen ab einer 3200-fachen Verdünnung (− 3,5 log) abzunehmen und dies ist vergleichbar mit den IL-6-Ergebnissen von Valentini et al. mit kryokonservierten Einzelspendern13. Dies gab die Gewissheit, dass die MAT ihren Zweck erfüllte. Der MAT kann mit mehreren Serumquellen durchgeführt werden, beispielsweise FBS oder HS. Beide Quellen wurden getestet und es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen FBS oder HS für omvPV(WT LPS) oder Bexsero beobachtet, allerdings schien der HS-basierte Assay nach der Stimulation mit OMVs etwas besser zu reagieren. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass OMV aus mehreren Komponenten gramnegativer Bakterien besteht. Frühere Ergebnisse unseres Labors haben gezeigt, dass der FBS-basierte MAT empfindlicher gegenüber dem Nachweis von Endotoxinen ist, während der HS-basierte MAT empfindlicher gegenüber Nicht-Endotoxin-Pyrogenen ist27. Das Ersetzen von FBS durch HS führt auch zu einem Test ohne tierische Bestandteile. Zusammen mit der Tatsache, dass HS-basierter MAT das menschliche Immunsystem besser widerspiegelt, wurde beschlossen, HS-basierten MAT für weitere Tests des MAT mit omvPV (WT LPS) zu verwenden.

Der Vergleich zwischen omvPV(WT LPS) in einer Dosierung von 100 μg/ml und der menschlichen Dosis von Bexsero (enthält 50 μg/ml omvNmB, drei rekombinante Proteinantigene und Aluminiumhydroxid) in HS-basiertem MAT zeigte, dass diese Anfangsdosis von omvPV(WT LPS), das aus Mäusestudien gewonnen wurde, war viel reaktogener als Bexsero. Dieser Unterschied kann auf die unterschiedliche Expression von PAMPs in den OMV-Produkten zurückzuführen sein, da diese von unterschiedlichen Bakterien stammen. Wir haben gezeigt, dass die Reaktogenität unseres omvNmB mit der von Bexsero vergleichbar war. Darüber hinaus könnte das Vorhandensein der in Bexsero und omvNmB vorhandenen Lpxl1-Modifikation zu einer verringerten Reaktogenität führen28. Darüber hinaus kann auch das Vorhandensein von Aluminiumhydroxid in Bexsero, das in omvPV(WT LPS), omvPV(LpxA), omvNg oder omvNmB nicht vorhanden ist, den Grad der Reaktogenität beeinflussen. Die Senkung der omvPV(WT LPS)-Dosis auf 20 μg/ml führte zu IL-6-Reaktionen, die mit denen von Bexsero vergleichbar waren.

Wir haben gezeigt, dass während der (frühen) Entwicklung eines OMV-basierten Impfstoffs die MAT mit einer Referenzcharge (in diesem Fall Bexsero) durchgeführt werden kann, die sich vom getesteten Produkt unterscheidet. Zu einem späteren Zeitpunkt sollte jedoch jeder OMV-Typ anstelle von Bexsero eine eigene Referenzcharge erhalten. Denn oft liefert eine nicht verwandte Referenzcharge IL-6-Kurven, die nicht perfekt parallel zur getesteten Charge sind; oder die maximale IL-6-Freisetzung, die mit der getesteten Charge und der Referenzcharge erreicht wurde, ist unterschiedlich. Dies kann beim Vergleich der getesteten Proben mit der Referenzcharge durch einen parallelen Linientest, z. B. für routinemäßige Konsistenztests der Produkte, zu Schwierigkeiten führen. Wenn ein pyrogener Gehalt für die Chargenfreigabe bestimmt werden muss, ist es umso wichtiger, zu einer Referenzcharge zu wechseln, die dem Produkt ähnelt, da es möglich ist, dass bei einem Wechsel der HS-Charge oder PBMC-Charge die Reaktogenität der getesteten Proben beeinträchtigt wird nicht derjenige der nicht verwandten Referenzcharge beeinflusst wird oder umgekehrt und dies könnte Auswirkungen auf die Beurteilung des Pyrogengehalts haben.

Diese Studie ergab, dass das mit dem RPT erhaltene Reaktogenitätsprofil für die meisten Produkte mit dem MAT wiedergegeben werden konnte, was zeigt, dass dieser Assay als Alternative zu Tierversuchen dienen könnte. Bemerkenswerterweise zeigte diese Studie jedoch auch, dass die MAT möglicherweise die menschliche In-vivo-Situation besser widerspiegelt und daher Reaktogenitätsprofile offenbart, die mit der RPT nicht erfasst worden wären. In dieser Studie wurde die erwartete Verringerung der Reaktogenität der LpxA-Modifikation im omvPV im Vergleich zum omvPV(WT LPS) im MAT nicht beobachtet, während diese Verringerung im RPT beobachtet wurde. Gereinigtes LpxA war jedoch im Vergleich zu gereinigtem WT-LPS weniger reaktogen, was beweist, dass die LPS-Modifikation im MAT nachgewiesen werden konnte. Diese verringerte Reaktogenität von gereinigtem LpxA im Vergleich zu WT-LPS wurde bereits im RPT17 gezeigt. Diese Studie zeigte auch, dass die Reaktogenität von gereinigtem LpxA auf dem gleichen gewünschten Niveau lag wie die von aPV. Die höhere Aktivierung von TLR2 durch omvPV(LpxA), wahrscheinlich aufgrund einer größeren oder unterschiedlichen Lipoproteinzusammensetzung auf der Außenmembran, kann eine stärkere IL-6-Reaktion der menschlichen PBMCs gegenüber omvPV(LpxA) verursachen und möglicherweise erklären, warum kein Unterschied beobachtet wurde in der MAT trotz des Vorhandenseins der LPS-Modifikation. Darüber hinaus könnten Menschen im Vergleich zu Kaninchen empfindlicher auf TLR2-Agonisten reagieren, wie Schindler et al. für IL-1 in einer Vollblut-MAT-Einstellung29. Die in dieser Studie gezeigte TLR2- und TLR4-Aktivierung durch omvPV(WT LPS und omvPV(LpxA) wurde zuvor auch für OMV-haltige Impfstoffe aus NmB nach intramuskulärer Verabreichung an Mäusen beobachtet28.

In dieser Studie wurde ein neuer Keuchhusten-Impfstoffkandidat auf Basis von Außenmembranvesikeln verwendet, um die MAT zu optimieren und mit der RPT zu vergleichen. Dieser verbesserte Pertussis-Impfstoff soll ein breiteres Immunitätsprofil in Bezug auf Antigen-Targeting, Antikörperreaktion und T-Zell-Reaktion3,30 im Vergleich zum aktuellen aPV19,31 induzieren. Allerdings sollte der Impfstoff ein mit dem aPV vergleichbares Sicherheitsprofil aufweisen und daher deutlich weniger reaktogen sein als das derzeitige wPV. Die aktuelle Studie hat sowohl mit dem RPT als auch mit dem MAT erstmals nachgewiesen, dass das omvPV tatsächlich ein gewünschtes Sicherheitsprofil hinsichtlich der systemischen Reaktogenität aufweist. Dies wurde entweder durch eine Modifikation des LPS, eine Änderung der Dosierung, eine intranasale Verabreichung oder eine Kombination davon erreicht. Wichtig ist, dass insbesondere mit omvPV(LpxA), aber auch mit omvPV(WT LPS) verschiedene Strategien möglich sind, die im Vergleich zu wPV zu einem weniger reaktogenen Profil führen. Dieser Befund steht im Einklang mit dem, was wir zuvor in unserem In-vivo-Mausmodell beobachtet haben, bei dem das omvPV(WT LPS) im Vergleich zum reaktogeneren Ganzzellimpfstoff weniger ausgeprägte proinflammatorische Reaktionen hervorrief, während die gleiche Art und das gleiche Maß an Immunität erhalten blieben Schutz3. Es ist zu beachten, dass der in dieser Studie verwendete internationale wPV-Standard nicht mit Alaun adjuviert ist, wie dies bei den meisten kommerziellen wPV-haltigen Kombinationsimpfstoffen der Fall ist. Die empfohlene Dosierung von 100 µg/ml Gesamtprotein für die intramuskuläre Immunisierung mit dem omvPV(WT LPS) ist jedoch im Vergleich zu z. B. Bexsero zu reaktogen, eine fünffache Reduzierung der Dosis führt jedoch zu einem günstigen Sicherheitsprofil. Weitere Untersuchungen sollten bestätigen, ob bei dieser Dosis Immunogenität und Schutzkapazität intakt bleiben. Interessanterweise wurde im RPT für beide OMV-Typen kein Fieber beobachtet, wenn eine hohe Dosis intranasal verabreicht wurde; die Ergebnisse waren mit denen der Kochsalzlösungsgruppe vergleichbar. Eine höhere Verträglichkeit der Reaktogenität an Schleimhautstellen könnte diese Beobachtung erklären. Dies könnte darauf hindeuten, dass für die Verabreichung über die Schleimhaut ein breiterer Dosierungsbereich getestet werden kann, da die systemische Reaktogenität weniger besorgniserregend zu sein scheint. Die Verabreichung von Pertussis-OMVs über die Schleimhaut führt auch zu einem besseren Schutz im Vergleich zur systemischen Immunisierung, wie unsere Gruppe bereits gezeigt hat25,26. Basierend auf dem Vergleich dieser Studie können wir auch den Schluss ziehen, dass die MAT bei der Verabreichung von Impfstoffen über die Schleimhaut die RPT leider nicht ersetzen kann, da sie die lokale Verabreichung nicht nachahmen kann. Und obwohl es bei der RPT nach intranasaler Immunisierung mit omvPV offenbar keine systemische Reaktogenität gibt, sollten lokale Sicherheitsbedenken mithilfe anderer In-vivo- oder In-vitro-Tests weiter untersucht werden. Zusammengenommen sprechen die aktuellen Erkenntnisse für den vielversprechenden Ansatz der Schleimhautimmunisierung mit Pertussis-OMVs, jedoch kann auch eine systemische Immunisierung mit OMVs in niedrigeren Dosen oder mit einer LPS-Modifikation als verbesserter Pertussis-Impfstoff eingesetzt werden.

Insgesamt können wir aus dieser Studie den Schluss ziehen, dass die angepasste MAT in mehreren Phasen der Impfstoffentwicklungskette angewendet werden kann, z. B. beim Screening experimenteller Impfstoffe, bei der Überwachung der Reaktogenität von Impfstoffen vor klinischen Studien (präklinische Phasen) und bei Chargenfreigaben während der im klinischen Stadium, um die Reaktogenität von pyrogenhaltigen Impfstoffen wie den OMV-Impfstoffen zu bestimmen. Der MAT kann einfach und schnell eingesetzt werden, um in Vorstadien der Impfstoffentwicklung erste Hinweise auf Reaktogenität zu liefern, wenn der RPT zu arbeitsintensiv und kostspielig ist. Darüber hinaus können mit diesem Test schnell Modifikationen des Impfstoffs zur Verringerung der Reaktogenität überprüft werden. Für Endprodukte kann der MAT als wertvoller Test neben oder möglicherweise als Ersatz für den RPT dienen, um die Reaktogenität von pyrogenhaltigen Impfstoffen zu beurteilen. Schließlich haben wir mit dem MAT in Kombination mit den Ergebnissen des RPT bewiesen, dass unser Keuchhusten-Impfstoff auf Basis von Außenmembranvesikeln ein sicheres Reaktogenitätsprofil aufweist, das für einen verbesserten Keuchhusten-Impfstoff erforderlich ist.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Marijke WA Molenaar-de Backer, Paulien Doodeman, Fereshte Rezai und Els M. Plagmeijer

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Lisa M. Verhagen, Arno van der Ark, Bernard Metz, Naomi van Vlies, Olga Ophorst und René HM Raeven

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MM-dB: Datenkuratierung, Untersuchung, Methodik, Analyse, Projektverwaltung, Schreiben und Bearbeiten. PD: Untersuchung und Analyse. FR: Untersuchung und Analyse. LV: Untersuchung, Analyse von Zelllinienexperimenten, Schreiben, Rezension. AvdA: Ressourcen, Untersuchung und Projektverwaltung. EP: Untersuchung und Analyse. BM: Untersuchung, Projektverwaltung, Überprüfung und Bearbeitung. NvV: Untersuchung, Analyse von RPT-Experimenten, Schreiben und Review. OO: Konzeptualisierung, Untersuchung, Methodik, Analyse, Projektverwaltung und Überprüfung. RR: Konzeptualisierung, Untersuchung, Methodik, Analyse, Projektverwaltung, Schreiben und Bearbeiten. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Marijke WA Molenaar-de Backer oder Bernard Metz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Molenaar-de Backer, MWA, Doodeman, P., Rezai, F. et al. In-vitro-Alternative zur Reaktogenitätsbewertung von Impfstoffen auf der Basis von Außenmembranvesikeln. Sci Rep 13, 12675 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39908-7

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Eingegangen: 14. Februar 2023

Angenommen: 02. August 2023

Veröffentlicht: 04. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39908-7

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