Die funktionelle Divergenz von CYP76AKs prägt die Chemodiversität von Abietan

Mar 28, 2024

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4696 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Gattung Salvia L. (Lamiaceae) umfasst unzählige verschiedene Heilkräuter, wobei Terpenoide eine ihrer wichtigsten aktiven chemischen Gruppen sind. Diterpenoide vom Abietan-Typ (ATDs) wie Tanshinone und Carnosinsäuren sind spezifisch für Salvia und weisen eine taxonomische chemische Vielfalt zwischen den Abstammungslinien auf. Um zu klären, wie sich die chemische Diversität von ATD entwickelte, führten wir groß angelegte metabolische und phylogenetische Analysen von 71 Salvia-Arten durch, kombiniert mit Enzymfunktion, Ahnensequenz und Rekonstruktion chemischer Merkmale sowie vergleichenden Genomexperimenten. Dieser integrierte Ansatz zeigte, dass die linienübergreifende ATD-Vielfalt in Salvia durch Unterschiede in der Oxidation des Terpenoidgerüsts an C-20 induziert wurde, was durch die funktionelle Divergenz der Cytochrom-P450-Unterfamilie CYP76AK verursacht wurde. Diese Ergebnisse zeigen ein einzigartiges Muster der chemischen Vielfalt in Pflanzen, das durch den Verlust der Enzymaktivität und der damit verbundenen katalytischen Wege geprägt ist.

Pflanzliche Naturstoffe sind eine wertvolle Ressource für die pharmakologische Forschung und die Entwicklung gesundheitsbezogener Produkte, und ihre strukturelle Vielfalt steht im Zusammenhang mit verschiedenen biologischen Aktivitäten1. Sowohl Taxol, ein aus Taxus chinensis (Pilg.) Rehder gewonnenes Diterpenoid-Alkaloid, als auch Artemisinin, ein aus Artemisia annua L. gewonnenes Sesquiterpenoid, haben aufgrund ihrer außergewöhnlichen Antikrebs- bzw. Antimalariawirkung weltweit große Aufmerksamkeit erhalten2,3. Aufgrund der hohen Nachfrage nach Naturprodukten sind Ansätze zur Gewinnung spezifischer Verbindungen mittels Metabolic Engineering zu einem wichtigen Trend geworden, was die Aufklärung von Biosynthesewegen und die Identifizierung der an diesen Wegen beteiligten Schlüsselgene erforderlich macht.

Die meisten aus Pflanzen gewonnenen Naturprodukte sind spezialisierte Metaboliten. Die Aufklärung eines Biosynthesewegs ist jedoch begrenzt, wenn der Weg komplex ist und mehrere Schritte umfasst, was es schwierig macht, die relevanten Gene zu identifizieren4. Im Allgemeinen handelt es sich bei der Entstehung pflanzenspezialisierter Metaboliten um einen weiterentwickelten Abwehrmechanismus, der Pflanzen vor einer Flut biotischer und abiotischer Belastungen schützt, wobei sich die chemische Vielfalt in der Vielfalt ihrer Skelette und chemischen Modifikationen widerspiegelt5. Im Allgemeinen stammen ähnliche Skelette aus ähnlichen Biosynthesewegen innerhalb homologer Pflanzen. Naturstoffe, die auf den gleichen Grundgerüsten mit verschiedenen chemischen Modifikationen (z. B. Glykosylierung, Methylierung, Hydroxylierung, Acylierung, Prenylierung) basieren, sind jedoch innerhalb der Spezies unterschiedlich. Solche strukturellen Veränderungen spielen eine wichtige Rolle dabei, wie Pflanzen auf Veränderungen in der äußeren Umgebung für ihr Wachstum und ihre Entwicklung reagieren6.

Angesichts der rasanten Fortschritte in den jüngsten Omics-Technologien ist es nun möglich, den evolutionären Ursprung, die Verteilung und die Zusammensetzung von Metaboliten auf Abstammungsebene7 zu verfolgen und Aufschluss über ihre alten oder neuen Funktionen sowie die Entstehung und Verbreitung ihrer Biosynthesewege zu geben time8 Beispielsweise hat das Mint Plant Genome Project in dieser Hinsicht bedeutende Beiträge geleistet, indem es die Verteilungsmuster flüchtiger Terpenoide in der Familie der Lamiaceae9 untersuchte und die Strahlungen des Iridoid-Signalwegs über verschiedene Abstammungslinien hinweg erforschte10. Sie haben auch Einblicke in die Mechanismen gebracht, die hinter dem Verlust und der anschließenden Neuentwicklung der Nepetalacton-Biosynthese in der Nepeta-Linie stehen11. Ein weiteres sehr repräsentatives Beispiel ist der Ursprung von Morphinan in der Gattung Papaver (Papaveraceae). Durch die Verfolgung der Fusionsereignisse des STORR-Gens zwischen Papaver-Genomen und korrelierter Duplikationen des gesamten Genoms (WGDs), Chromosomenumlagerungen und Subgenomentwicklung12,13,14 wurde die Innovation dieses spezialisierten Metaboliten demonstriert. Daher ist die Aufklärung des genetischen Mechanismus für die Bildung der Artenvielfalt von Naturstoffen von großer Bedeutung für das Verständnis der Wege und die Bereitstellung synthetischer Elemente für die Stoffwechseltechnik und die molekulare Züchtung.

Tanshinone und Carnosinsäure-verwandte Verbindungen sind spezialisierte Diterpenoide vom Abietan-Typ (ATDs) in Lamiaceae15,16. Tanshinone wurden ursprünglich aus Salvia miltiorrhiza Bunge identifiziert und zur Behandlung von koronarer Herzkrankheit17, Angina pectoris18 und Myokardinfarkt19 eingesetzt. Carnosinsäure und ihre Derivate, die in Salvia officinalis L. vorkommen, haben starke antioxidative16, antiparasitäre20, antitumorale21, antimykotische22, antiadipogene23 und antibakterielle24 Wirkung. Die spezifische Biosynthese dieser ATDs beginnt mit der Biosynthese ihres gemeinsamen Vorläufers Miltiradien und wird durch Copalyldiphosphat-Synthase (CPS) und Kauren-Synthase-ähnliche (KSL) katalysiert25. In S. miltiorrhiza katalysiert CYP76AH1 die Oxidation von Miltiradien an C-12 unter Bildung von Ferruginol26. Darüber hinaus können andere Mitglieder der CYP76AH-Unterfamilie die Oxidation von Miltiradien an C-7, −11 und −12 katalysieren, um eine Metabolitenanordnung mit vielfältigen Modifikationen an ATD-Ringen zu erzeugen 27, 28, 29, 30. Die CYP76AK-Unterfamilie fördert die Spezifität und Vielfalt der ATDs in Salvia weiter. CYP76AK6 aus S. officinalis, Salvia fruticosa Mill. und Salvia pomifera L., CYP76AK7 und CYP76AK8 aus Salvia rosmarinus Schleid wandeln 11-Hydroxyferruginol in Carnosinsäure um, indem sie eine Carboxylgruppe an C-2028,29,30 erzeugen, während CYP76AK1 aus S. miltiorrhiza nur eine Hydroxylierung an C-20 durchführt, um eine zu erzeugen Alkoholgruppe27. Dies legt nahe, dass die funktionelle Vielfalt von CYP76AKs zum Vorhandensein verschiedener Arten von ATDs in verschiedenen Salvia-Arten beitragen kann. Darüber hinaus ist anzumerken, dass das an der C-20-Position vorhandene Oxidationsmuster auch eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Miltiron, dem wichtigsten Vorläufer von Tanshinonen, spielen könnte. Dies kann den Demethylierungsprozess (der zum Verlust von C-20 führt) und die Aromatisierung von Ring B beinhalten, die ungelöste katalytische Schritte im Weg bleiben (ergänzende Abbildung 1). Daher wäre eine linienweite Charakterisierung der ATD-Verteilung, der Funktionen von CYP76AKs sowie der relevanten Evolutionsereignisse erforderlich, um den Tanshinon-Biosyntheseweg aufzudecken. Darüber hinaus würde die Dynamik der CYP76AKs im Falle der Evolution der CYP-Familie in Pflanzen Einblicke in das Zusammenspiel zwischen Funktionsdivergenz und Genomentwicklung bei der Evolution des CYP76AK-Clans liefern31,32.

Salvia L. (Lamiaceae, Nepetoideae)33 ist die größte Gattung in der Familie der Lippenblütler und umfasst ca. 1000 Arten34 und mehrere kulturell und wirtschaftlich wichtige Arten, die als traditionelle Kräuter (z. B. S. miltiorrhiza und S. officinalis)35, Duftstoffe (z. B. Salvia sclarea L.)36 und Zierpflanzen (z. B. Salvia splendens Sellow ex.) verwendet werden Wied-Neuw.)37 und funktionelle Lebensmittel (z. B. Salvia hispanica L.)38. Salvia hat eine kosmopolitische Verbreitung, die aus drei Artenvielfaltzentren besteht: Mittel-Südamerika (ca. 500 Arten), Südwestasien-Mittelmeer (ca. 250 Arten) und Ostasien (ca. 100 Arten)34. Salvia ist für ihre große Vielfalt an ATDs bekannt, was sie zu einer geeigneten Modellgattung für die Untersuchung der evolutionären Ursprünge der ATD-Vielfalt macht39. Tanshinone reichern sich hauptsächlich in S. miltiorrhiza40, Salvia przewalskii Maxim.41 und Salvia yunnanensis CHWright42 an, während mit Carnosinsäure verwandte Metaboliten in europäischen Salbeiarten wie S. officinalis43, S. fruticosa44 und S. pomifera45 gefunden wurden. Es ist jedoch unklar, ob die Stoffwechselunterschiede ein isoliertes Ereignis oder eine konsistente Variation darstellen, die durch die Kladendifferenzierung innerhalb der Gattung verursacht wird. Daher ist das Gesamtkorrelationsmuster zwischen chemischer Diversität und genetischer Diversität, das auf einer robusten Phylogenie der Gattung basiert, die Grundlage für die Untersuchung der ATD-Bildung in dieser wirtschaftlich wichtigen Gattung.

Hier haben wir die Konzepte der phylogenetischen Rekonstruktion, Metabolomanalyse, Signalweganalyse und Evolutionsmechanismen kombiniert, um 71 Salvia-Arten zu charakterisieren und die molekularen und evolutionären Mechanismen zu untersuchen, die zur ATD-Diversität in der Gattung führten. Unsere Metabolomanalyse ergab die Verteilung von ATDs in dieser Gattung. Anschließend wurden In-vitro-Enzymaktivitätstests durchgeführt, um die Mechanismen zu untersuchen, durch die die CYP76AK-Unterfamilie an der Biosynthese von ATDs beteiligt ist. Darüber hinaus wurde ein Evolutionsmodell der CYP76AK-Unterfamilie vorgeschlagen, das auf vergleichender Genomik, phylogenetischen Analysen und der Enzymologie rekonstruierter biosynthetischer Enzyme der Vorfahren basiert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Entwicklung der CYP76AK-Familie möglicherweise eine wichtige Rolle für die chemische Vielfalt der ATDs in Salvia gespielt hat.

Zur Charakterisierung der chemischen Vielfalt und phylogenetischen Beziehungen innerhalb der Gattung Salvia, 77 Arten, darunter sechs Außengruppen (Melissa officinalis L., Mentha spicata L., Clinopodium polycephalum (Vaniot) CYWu & SJHsuan, Origanum vulgare L., Nepeta cataria L. und Prunella vulgaris L.) wurden für Analysen beprobt (Ergänzungsdaten 1), die die wichtigsten geografischen Verbreitungsgebiete (Amerika, Westasien, Europa und Ostasien) der Gattung mit Ausnahme Afrikas abdecken. Insgesamt haben wir 72 neue Transkriptome aus gemischten cDNA-Bibliotheken aus Blättern und Wurzeln generiert, was durchschnittlich 40.876 Transkripten mit 38,2 MB pro Art ergab (Ergänzungsdaten 1). Zusätzlich zu drei veröffentlichten Transkriptomen (M. officinalis, M. spicata und O. vulgare)9 und zwei Genomen (S. miltiorrhiza und N. cataria)11,46 wurden 77 Kerngensätze für unsere Analysen erhalten. Fünf Sätze orthologer Gruppen (OGs), bestehend aus 2178, 1532, 1169, 512 bzw. 130 orthologen Genen, wurden verwendet, um die Salvia-Phylogenie mithilfe einer Koaleszenzmethode in einem mehrstufigen Verfahren unter Berücksichtigung der Ausrichtungslänge und der Artenabdeckung zu rekonstruieren und andere Faktoren (Abb. 1; ergänzende Abbildungen 2–6). Monophylie der Gattung Salvia und sechs Untergattungen (Calosphace, Audibertia, Glutinaria, Sclarea, „Heterosphace“ und Salvia) wurden maximal unterstützt (Bootstrap-Unterstützung [BS] = 100 %; Abb. 1; ergänzende Abb. 2-6). In Übereinstimmung mit früheren Phylogeniestudien47,48 wurde die Gattung in drei aufeinanderfolgende Hauptkladen (Klade I, II und IV) aufgeteilt, die ihre geografische Verteilung widerspiegelten, die grob in Eurasien, Amerika und Ostasien unterteilt werden konnte. Salvia abrotanoides (Kar.) Sytsma und S. rosmarinus, die zu den Untergattungen Perovskia und Rosmarinus (PR) gehören, sind Schwestern der Gruppe I. Somit lieferte die Phylogenie von Salvia eine gut unterstützte Gruppierung für weitere linienweite Stoffwechselprofile.

Fünf Ebenen von Bootstrap-Werten werden durch rote, blaue, gelbe, schwarze und grüne ausgefüllte Kreise gekennzeichnet. Grüne durchgezogene Kreise zeigen alternative Topologien für den Knoten unter den fünf Bäumen an (siehe ergänzende Abbildungen 2–6). Arten, die derselben Untergattung angehören, sind mit derselben Zweigfarbe gekennzeichnet. Die Namen der Arten werden rechts vom Baum angezeigt und die Klassen werden ganz rechts angezeigt und durch farbige Beschriftungen hervorgehoben. Farbige durchgezogene Sterne kennzeichnen die in dieser Studie identifizierte Genomduplikation. Vor Millionen Jahren, P Pliozän, Q Quartär, WGD Duplikation des gesamten Genoms, WGT Verdreifachung des gesamten Genoms. PR-Untergattungen Perovskia und Rosmarinus. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anhand des Baums, der aus 130 OG-Verkettungen für alle Taxa mit vier Fossilien als Kalibrierungspunkten erstellt wurde, wurde die Evolutionszeitskala der Salvia-Linien weiter geschätzt (Abb. 1, ergänzende Abb. 7). Unser Chronogramm zeigt, dass der Ursprung der Gattung Salvia in das späte Eozän (vor etwa 38,1 Millionen Jahren, Mya) bis in das mittlere Oligozän (vor etwa 26,1 Millionen Jahren) datiert werden konnte, da die Kronengruppe der Salvia schätzungsweise bei etwa 32,1 Millionen Jahren vorkam ein 95 %-Glaubwürdigkeitsintervall (KI) von 26,1–38,1. Kurz danach könnte die Kronengruppe von Clade I, Rosmarinus und Perovskia bei ~29,5 Mya aufgetreten sein (95 %-KI: 23,7–35,2). Parallel dazu könnte der Knoten, der sowohl Clade II als auch Clade IV enthält, bei ~28,2 Mya entstehen (95 %-KI: 22,7–33,8). Anschließend wurde geschätzt, dass Clade II und Clade IV bei etwa 22,1 Mya (95 %-KI: 17,6–27,0) bzw. etwa 9,1 Mya (95 %-KI: 6,7–11,8) voneinander abweichen.

Basierend auf den vorliegenden Transkriptomen und Genomdatensätzen identifizierten wir auch Ereignisse der Duplikation des gesamten Genoms (WGD) bei Salvia-Arten anhand synonymer Substitutionen pro Stelle (KS) bei paralogen Genpaaren (Abb. 1; ergänzende Abb. 8). Erstens wurden zwei zuvor bekannte WGD-Ereignisse, das von Kern-Eudikotyledonen geteilte Gamma-Ereignis (KS = 2,27 im Durchschnitt) und das gemeinsame WGD-Ereignis von Lamiaceae (KS = 1,18 im Durchschnitt)37,49, auf unserer Stichprobenskala bestätigt. Wir fanden kein gemeinsames WGD-Ereignis bei der gesamten Salvia-Gattung, identifizierten jedoch ein abstammungsgleiches WGD-Ereignis (KS = durchschnittlich 0,30) in Clade II. Darüber hinaus schienen einige einzelne Arten einzigartige WGD-Ereignisse durchlaufen zu haben, nämlich S. splendens, Salvia lyrata L. und Salvia roemeriana Scheele.

Das Verständnis der Relevanz zwischen chemischer Vielfalt und genetischer Information ist für die Aufklärung von Biosynthesewegen und die Gewinnung funktioneller Gene von entscheidender Bedeutung. Die Wurzeln und Blätter von 71 Salvia-Arten wurden mithilfe eines auf Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) basierenden Metabolomics-Ansatzes präpariert und analysiert. Chromatogramme des Gesamtionenstroms (TIC) zeigten, dass Phenolsäuren und ATDs die Hauptmetaboliten sowohl in den Wurzeln als auch in den Blättern von Salvia waren (Ergänzende Abbildungen 9–24). Nach der Peakerkennung, Ausrichtung und Normalisierung mit den MS-DIAL-Tools wurden die resultierenden Merkmalstabellen basierend auf dem Akkumulationsniveau von Phenolsäuren und ATDs in zwei Tabellen aufgeteilt und in SIMCA-P importiert, um zu untersuchen, mit welcher Klassifizierung von Metaboliten eng verbunden ist die Entwicklung von Salvia (Ergänzende Daten 2–7). Die Ansammlung von ATDs in Wurzeln und Blättern führte zu einer erkennbaren Aufteilung zwischen den vier Kladen mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) im Vergleich zu Phenolsäuren, insbesondere zu den Clustering-Ergebnissen im positiven Ionenmodus (Ergänzende Abbildungen 25 und 26), was mit dem übereinstimmte Ergebnisse der phylogenetischen Analyse (Abb. 1).

In Abb. 2a wurden die 36 häufigsten ATDs sowohl in Wurzeln als auch in Blättern der 71 Salvia-Arten identifiziert und anhand struktureller Merkmale in fünf Gruppen (A–E) eingeteilt. Referenzstandards und diagnostische Neutralverluste wurden verwendet, um die chemischen Modifikationen von Ringen und Methylgruppen an C-20 zu identifizieren (Ergänzungsdaten 8 und Abb. 27–31). Abbildung 2b zeigt die Akkumulationsmuster der 36 ATDs in den 71 Salvia-Arten sowie die Beziehungen zwischen chemischen Modifikationen und Organspezifität. Hydroxylierung und Carbonylierung an den Ringen waren die häufigsten Reaktionen in den ATD-Biosynthesewegen, die in allen vier Klassen von Salvia auftreten. Die Akkumulation von 20-Keto- und 20-Carboxyl-ATDs zeigte Speziesspezifität in Clade I, II und PR. Darüber hinaus wurde eine starke Organspezifität in carboxylierten und Epoxidderivaten wie Carnosinsäure und Carnosol nur in Blättern einzelner Arten aus Clade I, II und PR festgestellt. Im Gegensatz zu anderen ATDs mit 20 Kohlenstoffatomen zeigten Tanshinone (Gruppe B) eine stärkere Ionenreaktion im positiven Ionenmodus und reichern sich spezifisch in Wurzeln an. Obwohl die chemische Diversität von ATD aus verschiedenen chemischen Modifikationen von Ringen und Methylgruppen abgeleitet wurde, korrelierten das Akkumulationsmuster und die Organspezifität mit spezifischen Modifikationen der Methylgruppen. Miltiron (Verbindung 6 in Abb. 2), der Schlüsselvorläufer der Tanshinon-Synthese, war in allen Kladen vorhanden und wird durch die unklaren Reaktionen der gekoppelten Demethylierung von C-20 und des Aromatisierungsrings B auf Basis von 11-Hydroxyferruginol gebildet15. Vielfältigere Tanshinone, die durch anschließende Heterocyclisierung, Demethylierung und Aromatisierung gebildet werden, sind jedoch nur in Klade IV15 vorhanden. Daher ist C-20 eine potenziell kritische Position: Wenn die Ringe und Methylgruppen an C-20 durch verschiedene Substitutionen modifiziert werden, korreliert dies mit der Bildung verschiedener ATD-charakteristischer Strukturen und fördert die Spezies- und Organspezifität in Salvia.

a 36 ATDs wurden aufgrund unterschiedlicher struktureller Merkmale in fünf Gruppen eingeteilt. ATDs in den Gruppen A, C, D und E (die sich speziell in Blättern ansammelten) zeigten höhere Intensitäten im negativen Ionenmodus, und ATDs in Gruppe B (die sich speziell in Wurzeln ansammelten) zeigten höhere Intensitäten im positiven Ionenmodus. 1: 7, 20-Dihydroxyabietaquinon; 2: 16, 20-Dihydroxyabietaquinon; 3: 7-Keto, 20-Hydroxyabietaquinon; 4: 11, 20-Dihydroxysugiol; 5: 20-Hydroxyabietaquinon; 6: Miltiron; 7: Cryptotanshinon; 8: Tanshinon IIA; 9: 1,2-Dihydrotanshinchinon; 10: Dihydrotanshinon I; 11: Methylentanshinchinon; 12: Tanshinon I; 13: Przewachinon C; 14: 7-Keto-royleanon; 15: Royleanon; 16: 11-Hydroxysugiol; 17: 7-Hydroxyroyleanon; 18: 6-Hydroxyroyleanon; 19: 6-Keto-11-hydroxysugiol; 20: 7, 11-Dihydroxyferruginol; 21: 11, 14-Dihydroxysugiol; 22: 11-Hydroxyferruginol; 23: 20-Keto-2, 11-Dihydroxyferruginol; 24: 20-Keto-11-hydroxysugiol; 25: 20-Keto-7-hydroxyferruginol; 26: 20-Keto-6-hydroxyferruginol; 27: 20-Keto-7-acetyferruginol; 28: 7-Hydroxy-20-carboxyabietaquinon; 29: 7-Hydroxyisocarnosol; 30: 6-Hydroxycarnosol; 31: 7-Keto-Carnosinsäure; 32: 7-Methoxycarnosol; 33: 6-Methoxycarnosol; 34: Carnosol; 35: Carnosinsäure; 36: Methylcarnosat. b Verteilungsmuster der 36 ATDs in 71 Salvia-Arten. PR, Untergattungen Perovskia und Rosmarinus. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da das Oxidationsmuster an C-20 zu einer Divergenz der ATDs zwischen den Salvia-Linien führen könnte. Somit könnte CYP76AK, eine Lamiaceae-spezifische CYP-Unterfamilie, von der zuvor entdeckt wurde, dass sie die C-20-Oxidation 27,28,29,30,32 katalysiert, diese Stoffwechselvielfalt geprägt haben. Um die Enzymaktivität über die CYP76AKs hinweg zu untersuchen, wurden alle CYP76AK-Gene anhand der 71 von uns generierten Transkriptome annotiert, um zunächst ihre phylogenetische Beziehung zu untersuchen. Insgesamt wurden 185 mutmaßliche Sequenzen voller Länge erhalten und zur Erstellung eines Maximum-Likelihood-Baums (ML) verwendet (Abb. 3), der die CYP76AK-Unterfamilie in neun gut aufgelöste Klassen (nämlich CYP76AK1, 2, 3, 5, 6) einteilte , 7, 8, 18 und 22; Ergänzende Daten 9 und Abb. 32) mit breiter taxonomischer Verteilung. CYP76AK6s waren einzigartig für Clade I und außerdem die einzige CYP76AK-Clade in dieser Abstammungslinie. CYP76AK7, 22, 18 waren spezifisch für die Clade-II-Linie. Unterdessen waren CYP76AK1, 2 und 3 grundsätzlich spezifisch für die Clade-IV-Linie. Außerdem wurden die Gene CYP76AK3, 7, 8 und 22 auch aus den Transkriptomen von PR annotiert.

Die Zweigfarbe stellt die Abstammungslinie dar, zu der die Arten gehören, die diese CYP76AK-Gene enthalten. Das kommentierte Phylogramm finden Sie in der ergänzenden Abbildung 32. PR, Untergattungen Perovskia und Rosmarinus. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Bisher wurden nur wenige CYP76AK-Mitglieder funktionell charakterisiert27,28,29,30. Um zu untersuchen, ob jede Klade unterschiedliche katalytische Eigenschaften aufweist, wurden insgesamt 16 CYP76AKs, die alle Kladen abdecken, für eine In-vitro-Funktionsuntersuchung mithilfe eines Hefe-Mikrosomen-Expressionssystems ausgewählt. Zwei Substrate, 11-Hydroxyferruginol und 11-Hydroxysugiol, wurden getestet, um die Oxidationsmuster an C-20 aufzuklären. Da 11-Hydroxyferruginol nicht im Handel erhältlich war, wurde SmCYP76AH3 in den Hefestamm WAT11 eingeführt, um Ferruginol in 11-Hydroxyferruginol als Substratquelle zu übertragen (Abb. 4a). Die sequentiellen Oxidationsprodukte wurden mittels LC-MS gemäß ihren MS-Merkmalen analysiert (ergänzende Abbildung 33). Bei Verwendung von 11-Hydroxyferruginol als Substrat wurden zwei Produkte (11,20-Dihydroxyferruginol und Carnosinsäure) erzeugt, die die Produkte für die Hydroxylierung und Carboxylierung an C-20 darstellen. Unter den von uns getesteten CYP76AKs wurden keine Produkte für SmCYP76AK3 und 5 beobachtet. SmCYP76AK2, SpCYP76AK22 und ScCYP76AK18 zeigten Hydroxylierungsaktivität und nur ScCYP76AK18 wies anschließende Carboxylierungsaktivität auf. Zusammen mit den früheren Funktionsbeschreibungen zu CYP76AK1, 6, 7 und 827,28,29,30 gehen wir davon aus, dass CYP76AKs drei unterschiedliche katalytische Eigenschaften gegenüber 11-Hydroxyferruginol aufweisen, d. h. CYP76AK1, 2 und 22 können nur eine Hydroxylierung von aufweisen C-20, wohingegen CYP76AK6, 7, 8 und 18 die weiteren Oxidationseigenschaften hatten, um Carnosinsäure zu produzieren. Neben 11-Hydroxyferruginol konnte SmCYP76AK1 auch 11-Hydroxysugiol in 11,20-Dihydroxysugiol27 umwandeln. Um zu testen, ob auch andere CYP76AK-Kladen Promiskuitäten aufweisen, wurde 11-Hydroxysugiol in die Mikrosomenpräparate eingespeist, die jedes ausgewählte CYP76AK exprimierten (Abb. 4b). Infolgedessen waren alle CYP76AKs außer CYP76AK3 und 5 in der Lage, die C-20-Oxidation von 11-Hydroxysugiol zu katalysieren. Anders als bei der Verwendung von 11-Hydroxyferruginol als Substrat wurden in den Produkten von CYP76AK6, 7, 8 und 18 20-Keto-Produkte nachgewiesen. Darüber hinaus wurden carboxylierte Produkte (7-Keto-Carnosinsäure) gereinigt und durch Kernspinresonanz (NMR) identifiziert ), Ergänzende Abb. 34) wurden der Reihe nach erhalten. In Übereinstimmung mit den 11-Hydroxyferruginol-Ernährungsgruppen zeigten CYP76AK1, 2 und 22 nur eine einstufige Oxidation zur Bildung von 11,20-Dihydroxysugiol. Darüber hinaus haben wir auch komplementäre CYP76AKs aus jeder Gruppe zur Funktionsbestätigung ausgewählt (ergänzende Abbildung 35), was zeigt, dass CYP76AKs aus derselben Gruppe konsistente Funktionen hatten.

a Analyse des extrahierten Ionenchromatogramms (EIC) der katalytischen CYP76AK-Reaktionsprodukte in vitro mit 11-Hydroxyferruginol. Um 11-Hydroxyferruginol zu erhalten, enthielten alle Plasmide SmCYP76AH3, das Ferruginol in 11-Hydroxyferruginol umwandelt. Als Negativkontrolle fungierte eine Probe, die nur das SmCYP76AH3-Protein enthielt. Peaks, die potenziellen Produkten entsprechen, werden durch den m/z-Wert von 11,20-Dihydroxyferruginol (m/z 317,2115) und Carnosinsäure (m/z 331,1900) angezeigt. b EIC-Überlagerungen, die die katalytische In-vitro-Aktivität von CYP76AKs mit 11-Hydroxysugiol zeigen. Die Probe mit dem leeren Vektor (pESC-His) fungierte als Negativkontrolle. Peaks, die potenziellen Produkten entsprechen, werden durch den m/z-Wert von 11,20-Dihydroxysugiol (m/z 331,1900), 20-Keto-11-hydroxysugiol (m/z 329,1745) und 7-Keto-Carnosinsäure (m/z) angezeigt. z 345.1695). c Zusammenfassung der Enzymaktivität von CYP76AKs.

Insgesamt scheinen CYP76AKs drei Arten von katalytischen Eigenschaften zu erfüllen und gleichzeitig eine deutliche phylogenetische Divergenz einzuhalten (Abb. 4c): i: CYP76AK7, 6, 18 und 8 konnten eine katalytische sukzessive Oxidation an C-20 durchführen; ii: CYP76AK1, 2 und 22 zeigten nur den Hydroxylierungsschritt; iii: CYP76AK3 und 5 zeigten keine katalytische Fähigkeit sowohl gegenüber 11-Hydroxyferruginol als auch 11-Hydroxysugiol. Um die katalytischen Eigenschaften, die phylogenetische Beziehung der CYP76AK-Unterfamilie und die ATD-Verteilung umfassender zu berücksichtigen, scheint es eine starke Korrelation zwischen der Funktionsdivergenz von CYP76AKs und der artspezifischen Akkumulation von ATDs zwischen verschiedenen Salvia-Linien zu geben. Beispielsweise wurden 20-Keto-Produkte wie 20-Keto-11-hydroxysugiol spezifisch durch CYP76AK6, 7, 8 und 18 erzeugt. Dementsprechend waren solche 20-Keto-ATDs zusätzlich zum PR auf Clade I, II beschränkt (Abb . 2), die mit der Verteilung der CYP76AK-Kladen übereinstimmten, d. h. CYP76AK6 könnte für Klade I, CYP76AK7 und 8 für Klade II der Gattung beitragen.

Organbeschränkte Transkriptionsmuster von CYP76AK-Genen lieferten weitere Belege für deren Beitrag zur ATD-Diversität. Mittels RNA-Sequenzierung testeten wir Transkriptionsmuster von CYP76AK-Genen in Blättern und Wurzeln von siebzehn ausgewählten Salvia-Arten (Abb. 5) und enthüllten deren Verteilung nach Abstammungslinien und verschiedenen organspezifischen Expressionsmustern. Im Allgemeinen hatten CYP76AK-Gene, die zur gleichen Gruppe gehörten, ein identisches Transkriptionsmuster und zeigten eine identische Organverteilung wie die entsprechenden Metaboliten in der Abstammungslinie. Beispielsweise katalysierten CYP76AK1 und 22 in Clade IV bzw. Clade II ausschließlich die C-20-Hydroxylierung mit wurzelspezifischer Expression, was ihre besondere Rolle bei der Produktion von Tanshinonen demonstriert. Im Gegensatz dazu wurden 20-Carboxyl-Produkte wie Carnosinsäure spezifisch in den Blättern der Basallinien von Clade I bzw. Clade II angesammelt, was höchstwahrscheinlich auf die organspezifische Expression von CYP76AK6, 7, 8 und 18 zurückzuführen ist in Blättern entsprechender Salvia-Arten. Es ist zu beachten, dass CYP76AK3 und 5 zwar keine Aktivität gegenüber den getesteten Substraten in unserer Studie zeigten, in den Wurzeln der relevanten Salvia-Arten jedoch erhebliche Transkriptionsniveaus gefunden wurden, was auf deren nicht offenbarte katalytische Funktionen gegenüber anderen nicht identifizierten Substraten hinweist.

Genexpressions-Heatmap für Mitglieder der CYP76AK-Unterfamilie von repräsentativen Arten jedes Zweigs von Salvia, die die relativen Expressionsniveaus in Blättern (L) und Wurzeln (R) anzeigt. Die Heatmap zeigt drei biologische Replikate, jeweils einzeln dargestellt. Ausdruckswerte stellen Z-Score-transformierte Protokollwerte (TPM + 1) dar. Artenabkürzungen finden Sie in den Zusatzdaten 1. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die oben genannten phylogenetischen, metabolischen und katalytischen Funktionsstudien zeigten, dass diese deutliche metabolische Divergenz mit der Entwicklung der CYP76AK-Unterfamilie in jeder Salvia-Linie einherging. Um den evolutionären Weg des ATD-Signalwegs in Salvia zu verfolgen, wurden eine vergleichende Genomanalyse und die Rekonstruktion von Ahnengenen und Stoffwechselmerkmalen durchgeführt. Derzeit sind sechs Salvia-Genome verfügbar, die es uns ermöglichen, die Evolutionsgeschichte der CYP76AK-Gene in den meisten Salvia-Linien zu untersuchen. Dies sind S. rosmarinus50 (PR), S. officinalis30 (Klade I), S. miltiorrhiza46 und Salvia bowleyana Dunn51 (Klade IV), S. hispanica52 (nordamerikanische Abstammungslinie von Klade II) und S. splendens37 (südamerikanische Abstammungslinie von Klade II). Zunächst wurden Mikrosyntenieblöcke untersucht, um die Evolutionsgeschichte von CYP76AKs zu bestimmen (Abb. 6a). Konservierte syntenische Regionen, die CYP76AKs enthielten, wurden in allen untersuchten Genomen beobachtet und befanden sich nicht im bekannten Gencluster im Zusammenhang mit der Diterpenoid-Biosynthese30,53. Im Genom von N. cataria waren zwei duplizierte Regionen vorhanden, die die Rückverfolgung des Vorfahren der CYP76AK-Gene vor der Artbildung von Salvia ermöglichten. In der Zwischenzeit wurde eine Duplikation der Region entdeckt, die eine offensichtliche Korrelation mit dem WGD-Ereignis jedes Genoms zeigte. Bei N. cataria und S. rosmarinus wurde die Duplikation wahrscheinlich durch ihre einzigartigen WGD-Ereignisse hervorgerufen. Im Genom von S. hispanica hing die Duplikation mit der gemeinsamen WGD der Clade II zusammen. Anschließend erlebte S. splendens ein weiteres einzigartiges WGD-Ereignis, das schließlich zu einem Genom mit vier duplizierten Regionen führte. Somit deutete die Entdeckung der syntenischen Regionen und ihrer Duplikationsereignisse darauf hin, dass diese Region angestammte CYP76AKs im Genom des Salvia-Vorfahren enthielt. Im Zuge der Genomentwicklung entstand CYP76AK und entwickelte sich zu unterschiedlichen Gruppen in verschiedenen Salvia-Linien. In der Phylogenie sowohl von CYP76AKs (Abb. 3) als auch von Salvia könnten CYP76AK7 und 22 zuerst im Vorfahren der Salvia-Linien aufgetaucht sein, wie im Genom von S. rosmarinus gezeigt, und nachfolgende Duplikationsereignisse führten dann zu CYP76AK8 (S. rosmarinus). und CYP76AK18 (Klade II). In Taxa, die keine WGD-Ereignisse durchlaufen haben, wird CYP76AK in CYP76AK1 (Klade IV) und CYP76AK6 (Klade I) unterteilt. Darüber hinaus wurde keine Kollinearitätsbeziehung für CYP76AK2, 3 und 5 in allen Salvia-Genomen entdeckt (Supplementary Data 10). Ihre Entstehung könnte durch einzigartige Duplikationsereignisse bei bestimmten Arten oder Abstammungslinien verursacht worden sein (z. B. segmentale und Transposon-vermittelte Duplikation)54.

a Syntenische Beziehungen zwischen CYP76AK-Genen in Salvia-Genomen zeigten die Divergenz der CYP76AK-Kladen. Der phylogenetische Baum im linken Feld repräsentiert die Phylogenie von sechs Salvia-Arten mit N. cataria als Außengruppe. WGD-Ereignisse werden durch rote Punkte angezeigt. Mikrosyntenie von CYP76AK-Genen in den Syntenieblöcken. Rote Polygone zeigen syntenische Beziehungen zwischen CYP76AK-Genen und graue Polygone zeigen andere Gene. Anc-CYP76AK, Ancestral CYP76AK-Gen. b Rekonstruktion der ursprünglichen CYP76AK-Proteine. Die Ahnenknoten (ancNodes) 1–6 zeigen das wiederauferstandene Enzym jedes Hauptverzweigungspunkts des phylogenetischen CYP76AK-Baums. Funktionszeichen jedes Zweigs werden durch unterschiedliche Farben unterschieden. c, d Ahnenfunktion von CYP76AKs. Extrahierte Ionenchromatogramme (EICs), die die katalytische In-vitro-Aktivität jedes angestammten CYP76AK unter Verwendung von 11-Hydroxyferruginol bzw. 11-Hydroxysugiol als Substrat zeigen. e Entwicklung der ATD-Biosynthese in Salvia. Der phylogenetische Baum zeigt die Artbildung der Salvia-Kladen, und die Rauten stellen die vorhergesagten Stoffwechselmerkmale der Vorfahren für jeden Artbildungsknoten dar. Quadratische Rahmen stellen die realistischen Stoffwechselmerkmale jeder Salvia-Klade dar, wie in Abb. 3 dargestellt. Grün, Rot und Hellblau stellen die Existenz von Carnosinsäure, Tanshinonen bzw. 20-Keto-ATDs dar. Die Zeitskala auf der linken Seite spiegelt den Zeitpunkt der Artbildung für jede Gruppe wider. Hellblau hervorgehobene Zweige weisen auf Kladen hin, in denen die Stoffwechselmerkmale der Vorfahren erhalten geblieben sind. f Chronologie der CYP76AK-Gene. Der phylogenetische Baum stellt die Entwicklung der CYP76AK-Kladen gemäß dem MCMCtree-Modell dar. Die Artbildungszeit für jede Gruppe ist beschriftet. Blau hervorgehobene Zweige weisen auf CYP76AK-Kladen hin, die ihre angestammten katalytischen Funktionen beibehalten haben, und rot hervorgehobene Zweige weisen auf Kladen hin, die einen Funktionsverlust erlitten haben. Die Pfeile unten zeigen die CYP76AK-Klade an, die zur Produktion des ATD-Typs in der entsprechenden Linie beiträgt. Grüne, rote und indigograue Pfeile zeigen die Biosynthese von Carnosinsäure, Tanshinonen bzw. 20-Keto-ATDs an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In Anbetracht der funktionellen Unterschiede zwischen CYP76AKs im Kontext ihrer Evolutionsgeschichte schien die Divergenz der katalytischen Aktivität an C-20 eher einen taxonomischen Funktionsverlust als eine Neofunktionalisierung darzustellen. Daher wurden eine Rekonstruktion des Ahnengens und eine Funktionsvalidierung durchgeführt. Basierend auf der Phylogenie von CYP76AKs wurden sechs Verzweigungsknoten für die Auferstehung des Ahnenenzyms ausgewählt (Abb. 6b, Ergänzende Daten 11). Das jedem dieser Knoten entsprechende Stammenzym wurde in Hefe exprimiert und unter Verwendung von 11-Hydroxyferruginol und 11-Hydroxysugiol als Substraten funktionell bestätigt. Erwartungsgemäß zeigten alle CYP76AK-Vorfahren eine Hydroxylierung, Carbonylierung und Carboxylierung an C-20 von 11-Hydroxyferruginol und 11-Hydroxysugiol, da jedes Oxidationsprodukt von jedem CYP76AK-Vorfahren produziert wurde (Abb. 6c, d). Knoten 6 stellte das ursprünglichste CYP76AK-Protein dar, das eine vollständige Oxidationsfunktion aufwies, was darauf hindeutet, dass diese katalytische Eigenschaft von CYP76AKs bereits erworben worden war, als die CYP76AK-Unterfamilie erstmals in Salvia auftauchte. Knoten 3 (Vorfahr von CYP76AK1, 2, 5, 8, 18 und 22) und Knoten 2 (Vorfahr von CYP76AK1, 2, 5, 8 und 18) zeigten ebenfalls vollständige Oxidationskapazitäten gegenüber C-20, was darauf hindeutet, dass CYP76AK1, 2 und 22 (die nur eine Hydroxylierung durchführen) verlieren die Carboxylierungsaktivität. CYP76AK3 und 5 zeigten bei keinem der untersuchten Substrate eine katalytische Aktivität (Abb. 4), was darauf hindeutet, dass die CYPs in den beiden Kladen einen vollständigen Aktivitätsverlust gegenüber den getesteten Substraten erlitten. Sie könnten einer Pseudogenisierung unterliegen oder katalytische Aktivitäten gegenüber anderen unbekannten Substraten aufweisen.

Betrachtet man die Evolutionsgeschichte von CYP76AKs in Salvia, scheint die metabolische Diversität von ATDs eher einen Signalwegverlust als eine metabolische Innovation darzustellen. Daher wurde die Rekonstruktion des Ahnenphänotyps (APR) gemäß den realistischen chemischen Merkmalen in jedem Taxon durchgeführt, um die chemischen Merkmale ihrer gemeinsamen Vorfahren vorherzusagen (ergänzende Abbildung 36). Als Schlüsselmerkmale galten die Fähigkeiten, Carnosinsäure, Tanshinon oder 20-Keto-ATDs zu produzieren. Es wurde angegeben, dass APRs für die frühen Artbildungsknoten der Salvia-Phylogenie (PR und Clade I, II und IV) alle Arten von ATDs produzieren, was impliziert, dass der Vorfahre von Salvia höchstwahrscheinlich alle ATDs produzierte. Mit der Artbildung von Salvia blieb dieses chemische Merkmal in PR (S. rosmarinus) und den nordamerikanischen Taxa in der Abstammungslinie Clade II erhalten, ging jedoch in anderen Abstammungslinien teilweise verloren. In der Evolutionsgeschichte von CYP76AKs wurde ein Aktivitätsverlust auf Kladenebene beobachtet, was auf eine Hauptursache für die metabolische Diversität zwischen den Abstammungslinien schließen lässt. Um zu modellieren, wie die Entwicklung der Aktivität von CYP76AKs die ATD-Diversität beeinflusste, wurde die Chronologie aller CYP76AKs weiter bewertet (ergänzende Abbildung 37). Die CYP76AK-Kladen, die aus den syntenischen Segmenten der Vorfahren stammten, wurden vorgestellt (Abb. 6e, f). Die Chronologie ergab, dass die MRCA von CYP76AK (~76,4 Mya) zu einem Zeitpunkt vorhanden war, der viel früher war als die erste Divergenz zwischen CYP76AK7 und den anderen Kladen (~45,1 Mya). Jede Gruppe entstand zum Zeitpunkt oder kurz nach der Artbildung ihrer entsprechenden Abstammungslinien. Beispielsweise könnte CYP76AK6 zusammen mit der Artbildung von Clade I (~20,4 Mya) entstanden sein. Darüber hinaus trat der Aktivitätsverlust von CYP76AK22 (~26,3 Mya) und CYP76AK1 (~7,9 Mya) nach der Artbildung von S. rosmarinus (~27,2 Mya) bzw. Clade IV (~9,1 Mya) auf.

Basierend auf den katalytischen Merkmalen, der Abstammungsverteilung und dem Transkriptionsmuster jeder CYP76AK-Klade kann das Gen bestimmt werden, das zur ATD-Biosynthese in einer bestimmten Abstammungslinie beiträgt. CYP76AK7 wurde in S. rosmarinus und Clade II gefunden und trägt somit zur Carnosinsäure-Biosynthese in den oberirdischen Teilen der entsprechenden Abstammungslinie bei. Allerdings könnte CYP76AK7 auch für die Akkumulation von 20-Keto-ATDs in Wurzeln von Arten der südamerikanischen Taxa der Gruppe II verantwortlich sein. CYP76AK6 war nur in Clade I vorhanden; Somit könnte es die Biosynthese von Carnosinsäure-bezogenen Metaboliten und 20-Keto-ATDs in bestimmten Organen ermöglichen. CYP76AK22 blieb in S. rosmarinus und Clade II erhalten und wird nur in Wurzeln exprimiert, wo es für die Tanshinon-Akkumulation verantwortlich ist. Unterdessen trug CYP76AK1 nur in Klade IV zur Tanshinon-Biosynthese bei. Darüber hinaus hatte CYP76AK8/18 eine ähnliche Verteilung wie CYP76AK22 und könnte in Wurzeln eine Hydroxylierung und Carbonylierung für die Biosynthese von 20-Keto-ATDs durchführen. Insgesamt stützen frühere Studien zur metabolischen Entwicklung von ATDs und unsere Erkenntnisse zur funktionellen Divergenz der CYP76AK-Unterfamilie ein Modell der metabolischen Diversität in Salvia-Linien, das auf Aktivitätsverlust basiert.

In dieser Studie haben wir linienweite Phylogenie, Stoffwechselprofilierung, Genomvergleich und Enzymfunktionsentwicklungsanalysen kombiniert, um zu veranschaulichen, wie ATDs in der Gattung Salvia divergen. Unser Stoffwechselprofil für ATDs liefert das Modell für die Entwicklung des ATD-Signalwegs und dient als Beispiel für die chemische Vielfalt in Pflanzen aufgrund des Aktivitätsverlusts katalytischer Enzyme.

Frühere phylogenetische Rekonstruktionen von Salvia basierten hauptsächlich auf ribosomalen, mitochondrialen und Chloroplastengenen, wobei einige proteinkodierende Kerngene in der Phylogenie von Salvia auf Familienebene verwendet wurden47,48,55,56,57,58,59, 60. Die uniparentale Vererbbarkeit organellarer Gene sowie die Rekombination und Transformation von Genen im Plastidengenom haben zu phylogenetischen Rekonstruktionsverzerrungen und Ungenauigkeiten geführt61. Im Gegensatz dazu haben Kerngene viele Vorteile, wie zum Beispiel ihre große Anzahl und die elterliche Vererbung. Die Verwendung der gründlich evaluierten Kerngensätze kann Hinweise auf robuste und gut unterstützte tiefe Angiospermenlinien liefern62,63,64,65. Hier präsentierten wir eine phylogenetische Analyse von Salvia auf der Grundlage groß angelegter Kerngene, die aus der Transkriptomsequenzierung mit dem bisher größten Stichprobenmaßstab für die Salvia-Abstammungslinie gewonnen wurden, um auf infragenerische Beziehungen innerhalb der Gattung zu schließen. In Übereinstimmung mit früheren Studien bildeten S. abrotanoides und S. rosmarinus eine Gruppe mit Salvia-Arten, während M. officinalis als Schwestergruppe fungierte47,48,55,56,59,60.

Morphologisch unterscheidet sich die traditionell definierte Gattung Salvia von anderen Gattungen der Lamiaceae dadurch, dass zwei ihrer fruchtbaren Staubblätter durch ein deutlich verlängertes Bindegewebe getrennt sind. Durch molekulare phylogenetische Studien wurde Salvia jedoch um weitere Gattungen erweitert (z. B. Dorystaechas, Meriandra, Perovskia, Rosmarinus und Zhumeria)47,48,55,56,57,58,59,60. Obwohl hier Vertreter von „Rosmarinus“ und „Perovskia“ eine Schwestergruppe von Clade I bildeten (Abb. 1), unterscheiden sich die Stoffwechselmerkmale für ATDs und katalytische Eigenschaften von CYP76AKs in zwei Untergattungen deutlich von denen von Clade I. Somit sind die Die oben genannten Ergebnisse könnten neue Erkenntnisse aus weiteren Aspekten der taxonomischen Zuordnung von Dorystaechas, Meriandra und Zhumeria liefern.

CYPs oxidieren das Kohlenwasserstoffgerüst, das durch die Terpenoidsynthase während der pflanzlichen Terpenoidbiosynthese erzeugt wird, während chemische Modifikationen wie Hydroxylierung, kontinuierliche Oxidation, Ringumlagerung und Heterocyclisierung ebenfalls auftreten. Diese Reaktionen erhöhen die strukturelle Vielfalt von Terpenoiden erheblich und bieten gleichzeitig Ankerpunkte für zukünftige Strukturmodifikationen. Daher gelten CYPs als Schlüsselfaktoren für die Vielfalt pflanzlicher Terpenoide32. Unseren Metabolomanalysen zufolge zeigten ATDs mit modifizierten Ringen (Gruppe C) keine spezifische Akkumulation in allen Kladen und wurden von funktionellen Genen wie der CYP76AH-Unterfamilie produziert, die in der Lage ist, an C-7 des Rings B27 eine Carbonylierung durchzuführen. Im Gegensatz zu den durch CYP76AH durchgeführten Modifikationen werden die chemischen Modifikationen an C-20 durch die vielfältige CYP76AK-Familie gesteuert, die für die Akkumulation und Organspezifität von ATDs in Salvia verantwortlich ist. Nach Abb. Wie aus den Abbildungen 2 und 5 hervorgeht, wurde das CYP76AK1-Gen in Wurzeln von Taxa der Gruppe IV stark exprimiert und produziert 20-Hydroxyl-ATDs (Gruppe A), deren Akkumulationsmuster denen von Miltiron ähnelten, insbesondere für das 7,20-Dihydroxyabietaquinon (Verbindung). 1), 7-Keto-20-hydroxyabietaquinon (Verbindung 3) und 20-Hydroxyabietaquinon (Verbindung 5), wobei vermutet wird, dass die 20-Hydroxyl-ATDs die primären Vorläufer für die Miltiron-Synthese sind. Ähnlich wie CYP76AK1 wurde auch festgestellt, dass CYP76AK22 an C-20 hydroxylierte Derivate für die Miltiron-Synthese in einzelnen Arten aus Clade II und PR produziert und auch in Wurzeln ein hohes Transkriptionsniveau aufwies (Abb. 5). Im Gegensatz zu Clade I fallen Arten in Clade II, da S. pachyphylla, S. apiana und S. columbariae Cryptotanshinon produzieren. Die Produktion von Cryptotanshinon (Verbindung 7; Abb. 2) durch die CYP71D-Familie, die auf Miltiron für die Heterocyclisierung von Ring D einwirkt, zeigte, dass Klade-II-Arten einen umfassenderen Tanshinon-Biosyntheseweg aufwiesen als Arten in Klade I (Abb. 2)53. Allerdings waren die meisten stromabwärts gelegenen Tanshinone in Klade IV häufiger anzutreffen, was darauf hindeutet, dass die Biosynthese von ATDs in Klade IV überwiegend aus der Tanshinonsynthese (Gruppe B) bestand. Dies war möglicherweise auch der Grund dafür, dass sich die häufigen ATDs mit 20 Kohlenstoffatomen (Gruppe C) in Clade I und II in höheren Konzentrationen anhäuften (Abb. 2). Darüber hinaus erfordert die anschließende Aromatisierung von Ring A funktionierende Gene für die Hydroxylierung an C-18 oder −19, die ausschließlich in Clade IV exprimiert wurden. Außerdem wurde bei Verwendung von 11-Hydroxysugiol als Substrat (Zeit = 17, 25 min; Abb. 4b) ein Nebenprodukt von SmCYP76AK1 und ScCYP76AK22 nachgewiesen, das vorläufig als 6-Hydroxy-7-ketoabietaquinon identifiziert wurde (ergänzende Abb. 38). Diese Nebenfunktion könnte zu den ATDs mit Hydroxylgruppe an C-6 in Klade II (Verbindung 18) und IV (Verbindung 18, 26 und 30) beitragen. Dementsprechend muss die Reaktion der Enzyme auf die C-6-Oxidation in Clade I und PR noch untersucht werden.

Abgesehen von der Bedeutung von CYP76AK1 und CYP76AK22 für die Synthese von 20-Hydroxyl-ATDs und Tanshinonen basierte die einzigartige Akkumulation von 20-Keto-ATDs (Gruppe D) in Clade I, II und PR auf der spezifischen Expression von CYP76AK6, 7, und 18.08. Während CYP76AK6 ausschließlich in Klade I exprimiert wurde, wurden CYP76AK7 und 8/18 in Klade II und PR exprimiert und führten in den In-vitro-Enzymaktivitätstests ähnliche Aktivitäten der Hydroxylierung, Carbonylierung und Carboxylierung an C-20 durch (Abb. 4). In den Enzymaktivitätstests wurde festgestellt, dass die 20-Carboxylderivate wie Carnosinsäure (Verbindung 35) auch 20-Epoxid-ATDs wie Carnosol (Verbindung 34) spontan oxidieren (ergänzende Abbildung 39)28. Arten mit einer höheren Expression von CYP76AK6, 7 oder 8/18 in Blättern, wie S. officinalis in Klade I, S. columbariae in Klade II und S. rosmarinus in PR, waren jedoch die wenigen Arten mit beiden 20-Carboxylgruppen und 20-Epoxid-ATDs (Gruppe E) in Blättern (Abb. 2 und 5). Eine solche artspezifische Anreicherung von Carnosinsäure-bezogenen Metaboliten könnte mit der Fähigkeit zusammenhängen, den rauen klimatischen Bedingungen im Mittelmeerraum standzuhalten66. Blätter dieser Arten zeigten eine höhere Expression von CYP76AKs als Wurzeln, was möglicherweise mit der spezifischen Lokalisierung von 20-Carboxyl- und 20-Epoxy-ATDs in den Chloroplasten photosynthetischer grüner Organe zusammenhängt67,68. Carnosinsäure wurde zuvor als potenzielles Zwischenprodukt für die Demethylierung (C-20) vermutet, was zur Bildung einer heterozyklischen Brücke zwischen C-20 und C-7 führt. Dies wiederum deutete darauf hin, dass die Carbonsäuregruppe am C-20 für die Aromatisierung des Rings B15 verantwortlich sein könnte, was letztendlich zur Produktion von Miltiron führt. Die Anreicherung von Carnosinsäure war jedoch auf bestimmte Organe und Arten beschränkt, was darauf hindeutet, dass sie nicht als Vorstufe für Tanshinone dienen kann. Stattdessen zeigt die durch CYP76AK1 und 22 katalysierte Hydroxylierung (C-20) aufgrund ihrer Koexistenz und ähnlichen Akkumulationsmuster mit Tanshinonen in Gruppe IV eine stärkere Korrelation mit der anschließenden Demethylierung und Aromatisierung. Dies stellt einen bedeutenden Schritt in der mechanistischen Untersuchung des Bildungsprozesses von Tanshinonen dar, insbesondere im Verständnis der Mechanismen der Demethylierung und Aromatisierung. Daher könnte die variable Expression unterschiedlicher CYP76AKs zwischen evolutionären Kladen die Entwicklung des ATD-Biosynthesewegs steuern, was zur spezifischen Produktion von ATDs in Salvia führt, wie z. B. Tanshinonen und Carnosinsäure-verwandten Metaboliten.

Darüber hinaus können wir allein auf der Grundlage der In-vitro-Aktivitätsnachweise von CYP76AK nicht ausschließen, dass andere Enzyme an der nachfolgenden Oxidation von ATDs beteiligt sind. Ähnlich dem Artemisinin-Biosyntheseweg, obwohl In-vitro-Beweise zeigen, dass CYP71AV1 die aufeinanderfolgende Oxidation von Amorpha-4,−11-dien an C-12 unter Bildung von Artemisinaldehyd und Artemisinsäure sowie anderen Enzymen wie Alkoholdehydrogenase (ADH1) katalysieren kann Artemisin-Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH1) ist auch an den letzten beiden Oxidationsschritten in Drüsen-Trichomzellen von Artemisia annua69,70,71 beteiligt. Dies deutet auch auf die Möglichkeit der Beteiligung anderer Enzyme neben CYP76AK an der C-20-Oxidation von ATDs in Salvia hin, was weitere funktionelle In-vivo-Studien von CYP76AKs und die Entdeckung neuer Enzyme erfordert.

Es ist eher der Aktivitätsverlust von CYP76AKs als die Neofunktionalisierung, der die Vielfalt der ATDs in der Gattung Salvia vorangetrieben hat. Die durch WGD-Ereignisse verursachte Differenzierung und Expansion von CYP76AKs hat nicht wie in früheren Fällen72 zu Neofunktionalisierungen geführt, sondern zu einem Aktivitätsverlust in den entsprechenden Taxa (Abb. 6). Es ist interessant festzustellen, dass der Aktivitätsverlust auch Veränderungen in den Strukturmerkmalen und Verteilungsmustern ausgelöst hat, die zu einer metabolischen Diversität führen, wie beispielsweise der Produktion von Tanshinonen und Carnosinsäure-Derivaten. Im Gegensatz zu den meisten Fällen, in denen davon ausgegangen wird, dass funktionale Innovation zu metabolischer Diversität führt, deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass der Verlust von Aktivitäten auch der Schlüsselfaktor für metabolische Diversität sein könnte.

Andererseits weisen CYP76AKs im Hinblick auf die funktionelle Divergenz auch unterschiedliche Transkriptionsmuster auf, die letztendlich zur völlig entgegengesetzten organspezifischen Akkumulation von Carnosinsäurederivaten und Tanshinonen führen. Auf dieser Grundlage spekulieren wir, dass die physiologischen und ökologischen Funktionen dieser Metaboliten mit der in dieser Gattung vorhandenen Stoffwechseldivergenz zusammenhängen könnten. Beispielsweise reichern sich Carnosinsäure und Carnosol hauptsächlich in den Chloroplasten grüner Gewebe an und stellen so einen einzigartigen und wirksamen antioxidativen Mechanismus in den photosynthetischen Geweben dieser Pflanzen dar66. Der auf Carnosinsäure basierende Schutzmechanismus hat sich als entscheidend dafür erwiesen, dass Salvia-Arten rauen klimatischen Bedingungen standhalten können, während Tanshinone möglicherweise an der Interaktion zwischen Wurzeln und den Mikroorganismen im umgebenden Boden beteiligt sind73,74.

Darüber hinaus stellten die unterschiedlichen Transkriptionsmuster jeder CYP76AK-Klade einen weiteren Aspekt der Funktionsentwicklung dar. Ihre organspezifischen Muster sind nicht unabhängig, sondern werden von anderen katalytischen Genen begleitet, die an der Biosynthese von Carnosinsäurederivaten und Tanshinonen beteiligt sind, wie KSLs, CYP76AHs und CYP71Ds. Mittlerweile werden solche Muster in verschiedenen Salvia-Linien beibehalten30,53,75, was die Frage nach dem Ursprung ihrer organspezifischen Transkriptionen zu einem weiteren Forschungsthema aufwirft. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ATD-Differenzierung in Salvia ein vollständiges Modell darstellt, das mehrere Arten, Genfamilien, Stoffwechselvielfalt und ökologische Evolution umfasst, was sie zu einem idealen Forschungsobjekt für die genetischen Mechanismen macht, die für die chemische Vielfalt in Pflanzen verantwortlich sind.

Neueste molekulare phylogenetische Studien belegen das Vorhandensein von 11 Unterklassen in der Gattung Salvia (Subg. Audibertia, Subg. Calosphace, Subg. Dorystaechas, Subg. Glutinaria, Subg. Heterosphace, Subg. Meriandra, Subg. Perovskia, Subg. Rosmarinus, Subg. Salvia, Untergattung Sclarea und Untergattung Zhumeria)56,58,59,60. Ein phylogenetischer Baum von Salvia wurde erstellt, um ein Stichprobenschema zur Analyse der chemischen Vielfalt dieser Arten zu erhalten (Ergänzungsdaten 1). Insgesamt wurden 71 Arten aus drei Hauptverbreitungszentren dieser Gattung beprobt, die 8 der 11 anerkannten Unterklassen von Salvia repräsentieren. Sechs Arten (M. officinalis, M. spicata, C. polycephalum, O. vulgare, N. cataria und P. vulgaris) aus anderen Mentheae-Stämmen wurden als Außengruppen ausgewählt. Um ausreichend Material sowohl für Transkriptom- als auch für chemische Analysen zu erhalten, wurden Proben im vegetativen oder blühenden Stadium gesammelt. Im vegetativen Stadium wurden drei Organe (Wurzeln, Stängel und Blätter) und im Blütestadium vier Organe (Wurzeln, Stängel, Blätter und Blüten) gesammelt. Um die Probenahme desselben Gewebetyps für Transkriptom- und chemische Analysen zu ermöglichen, wurden Gewebe aus jedem Organ zu einem feinen Pulver zermahlen und in Aliquots aufgeteilt.

Um umfassendere Transkripte zu erhalten, wurde eine gemischte Orgelstrategie für den Bibliotheksaufbau durchgeführt, bei der die generierte Transkriptdatenbank für phylogenetische Studien verwendet wurde. Für die Transkriptionsprofilierung wurden Bibliotheken für einzelne Blätter und Wurzeln repräsentativer Pflanzen in jeder Gruppe erstellt (d. h. S. rypara, S. karwinskii, S. madrensis, S. pachyphylla, S. apiana und S. columbariae aus Gruppe II; S. castanea f. tomentosa, S. przewalskii, S. roborowskii, S. chinensis, S. trijuga, S. miltiorrhiza aus Klade IV; S. deserta, S. roemeriana, S. officinalis subsp. lavandulifolia, S. officinalis aus Klade I; S. rosmarinus aus PR)47,48. Die Gesamt-RNA wurde mit dem TransZol Plus RNA Kit (TransGen Biotech, Peking, China) isoliert. Die cDNA-Bibliotheken wurden mit dem Illumina TruSeq RNA-Probenvorbereitungskit (Illumina, San Diego, CA, USA) hergestellt und auf einem Illumina NovaSeq 6000-Sequenzierer sequenziert, wodurch 2 × 150-bp-Paired-End-Reads generiert wurden. Die Lesevorgänge wurden von fastp (https://github.com/OpenGene/fastp) mit Standardparametern bewertet und gekürzt. Die Transkriptassemblys wurden mit Trinity Assembler76 generiert. Für die Transkriptom-Annotation wurden alle Transkripte anhand der Arabidopsis thaliana-Proteom-, SwissProt- und Pfam-Datenbanken unter Verwendung von BLASTX, BLASTP und HMMER v3.1b2 mit einem E-Wert-Grenzwert von jeweils 1E-5 durchsucht77. Die Genexpressionswerte (Transkripte pro Million Reads [TPM]) wurden mit der RSEM-Software78 berechnet. Im Wesentlichen wurde die differenzielle Expressionsanalyse unter Verwendung von DESeq279 mit p-Anpassung <0,05 und |log2FC|≥ 1 als Schwellenwert durchgeführt. Die Gen-Heatmaps wurden mit TBtools (https://github.com/CJ-Chen/TBtools) mit der Heatmap Illustrator-Funktion erstellt.

Alle zusammengesetzten Transkripte wurden gefiltert, um die längsten Transkript-Isoformen beizubehalten, und die Proteinsequenzen wurden mit TransDecoder v5.5.080 weiter vorhergesagt. Orthologe Gruppen wurden mit OrthoFinder v2.5.481 unter Verwendung von TransDecoder-vorhergesagten Proteinsequenzen aller 77 Arten erstellt. In Anbetracht der Tatsache, dass eine fragmentierte Zusammenstellung, eine falsche Zusammenstellung, unzureichende Informationsstellen und andere Faktoren zu verzerrten Schlussfolgerungen führen können, umfassen die fünf Gensätze vier Gensätze mit geringer Kopienzahl, d. h. 2.178 OGs, 1.532 OGs, 1.169 OGs und 512 OGs sowie einen Für die Konstruktion des phylogenetischen Baums wurde ein Einzelkopie-Gensatz, dh 130 OGs, extrahiert. Die resultierenden Proteinsequenzen aus Einzel-/Low-Copy-Gensätzen wurden mit MAFFT v7.48782 unter Verwendung der Standardeinstellungen abgeglichen, und schlecht ausgerichtete Regionen wurden mit TrimAl v1.4 beschnitten. rev1583. Der phylogenetische Baum jedes Orthologen aus einzelnen OGs wurde mit RAxML-NG v1.0.384 mit 100 Replikaten unter dem JTT + I + G4-Modell erstellt. Anschließend wurde Astral v5.685 verwendet, um die Phylogeniebäume für jeden der fünf OG-Sätze mit 100 Replikaten von RAxML zu verketten, um die BS-Werte aller Knoten zu erhalten. Darüber hinaus wurden 130 OGs zu einer Supermatrix verkettet und die endgültige phylogenetische Beziehung wurde unter Verwendung von RAxML-NG v1.0.384 mit 1000 Replikaten unter dem JTT + I + G4-Modell rekonstruiert. Unter allen 77 Arten wurden M. officinalis, M. spicata, C. polycephalum, O. vulgare, N. cataria und P. vulgaris als Außengruppen ausgewählt.

MCMCTree im PAML-Paket v4.986 wurde für die Bayes'sche Schlussfolgerung der divergenten Zeitschätzung von Kandidatenarten verwendet. Als Eingabebaum wurde die Topologie der Kandidatenarten aus der ML-Rekonstruktion mit den verketteten 130 OGs verwendet. Die resultierenden Nukleotidsequenzen mit Codon-Substitutionsmodellen wurden mit MAFFT v7.48782 und dem „backtrans“-Parameter von TrimAl v1.4 abgeglichen und getrimmt. rev1583. Zunächst wurden die Verzweigungslängen und die Gesamtsubstitutionsrate (rgene gamma) mit dem BASEML-Programm im PAML-Paket v4.986 unter dem GTR + G-Modell gemessen. Zweitens wurde die Divergenzzeit mit MCMCtree geschätzt und die Parameter „Burn-in“, „sampfreq“ und „nSample“ auf 500.000, 150 bzw. 10.000 festgelegt. Die Divergenzzeit der möglichen Salvia-Arten wurde auf der Grundlage der folgenden Altersbeschränkungen für Fossilien geschätzt: 11–27 Mya für die Divergenz von C. polycephalum und M. spicata und 21–47 Mya für die Divergenz zwischen M. officinalis und den anderen Außengruppen. dh N. cataria, C. polycephalum, M. spicata, O. vulgare und P. vulgaris. Schließlich ergaben mehrere Iterationen der MCMCTree-Schätzung, dass die Abweichung der Divergenzzeit <0,1 % betrug.

KS-basierte Altersverteilungen für Paralogs aller Kandidatenarten wurden mithilfe der „wgd“-Pipeline87 erstellt. Kurz gesagt, die Paralogs für jede Art wurden mit dem Sequenzähnlichkeitssuchtool Diamond v0.9.18.119 mit einem E-Wert-Grenzwert von 1E-1088 identifiziert. Die paralogen Genfamilien wurden mithilfe des Markov-Cluster-Algorithmus89 geclustert. Die Gene innerhalb jeder paralogen Genfamilie wurden mit MAFFT v7.48782 jeweils mit den Standardparametern abgeglichen. Die KS-Werte aller paralogen Genpaare innerhalb einer Genfamilie wurden mit dem CodeML-Programm im PAML-Paket v4.986 gemessen. Die KS-Werte wurden anschließend knotengewichtet, um die Redundanz mit der phylogenetischen Baumkonstruktion für jede Familie unter Verwendung von FastTree v2.1.790 zu korrigieren. Die KS-Alterungsverteilung von Paralogs aller getesteten Arten ist in den grauen Balken der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt.

Angesichts der unterschiedlichen Substitutionsraten aller getesteten Arten wurden die artenspezifischen oder spezifischen WGD-Ereignisse mithilfe eines KS-basierten Baums weiter angepasst. Hier wurden 130 Einzelkopie-Gene aus OrthoFinder v2.5.481 für alle getesteten Arten verwendet, um die Zweiglängen der Phylogenie in der KS-Einheit unter Verwendung des CodeML-Programms im PAML-Paket v4.986 mit einem Free-Ratio-Modell zu berechnen.

Die Gene mit der Pfam-Domäne von PF00067 wurden als Mitglieder der CYP450-Familie identifiziert. Sieben bekannte CYP76AK-Gene (SmCYP76AK1: KR140169.1, S. miltiorrhiza; SmCYP76AK2: KP337688.1, S. miltiorrhiza; SmCYP76AK3: KP337689.1, S. miltiorrhiza; SfCYP76AK6: KX431218.1, S. fruticosa; SpCYP76AK6: KT157045.1 , S. pomifera; SrCYP76AK7: KX431219.1, S. rosmarinus; und SrCYP76AK8: KX431220.1, S. rosmarinus) wurden aus der NCBI-Datenbank als lokale CYP76AK-Datenbank heruntergeladen. BLASTP-Suchen wurden durchgeführt, um die entsprechenden CYP76AK-Gene mit einem E-Wert-Cutoff von 1E-5 zu identifizieren. Die Proteinsequenzen der ausgewählten CYP450-Gene, die Proteine ​​mit ≥466 Aminosäuren kodierten, wurden mit MAFFT v7.48782 und TrimAl v1.4 abgeglichen und getrimmt. rev1583 bzw. Die Phylogenie der CYP76AK-Gene wurde unter Verwendung des CYP76AH1-Gens als Außengruppe über ModelTest-NG v0.1.791 und RAxML-NG v1.0.37684 abgeleitet. Für CYP450-Gene, die Proteine ​​mit <466 Aminosäuren kodierten, wurden BLASTP-Suchen zur Klassifizierung der Kandidatengene verwendet.

Gemäß dem obigen phylogenetischen Baum wurde die molekulare Datierung von CYP76AKs verschiedener Arten mit MCMCTREE des PAML-Pakets v4.986 unter dem GTR + G-Modell (Modell = 7) mit 500.000 Iterationen und 150 Stichprobenfrequenzen analysiert, gefolgt von 500.000 Iterationen als Verbrennung -In. Die Substitutionsrate, d. h. rgene gamma, wurde unter Verwendung von BASEML des PAML-Pakets v4.986 als G (1, 5,95) berechnet. Der Kronenknoten von zwei Einzelkopie-Genfamilien (dh CYP76AK3 und 22) und zwei artspezifischen Genfamilien (dh CYP76AK1 und 6) wurden verwendet, um die Divergenzzeit jedes Knotens abzuschätzen. Wir haben für jedes Schätzverfahren die folgenden Altersbeschränkungen verwendet: ein Mindest- und Höchstalter von 23,7 und 35,2 Mya für den Kronenknoten von CYP76AK3 (die Divergenzzeit von S. abrotanoides und anderen Arten); ein Mindest- und Höchstalter von 21,8 und 32,9 Mya für den Kronenknoten von CYP76AK22 (die Divergenzzeit von S. rosmarinus und anderen); ein Mindest- und Höchstalter von 14,3 und 22,5 Mya für den Kronenknoten von CYP76AK6 (die Divergenzzeit von Clade I und anderen); ein Mindest- und Höchstalter von 6,7 und 11,8 Mya für den Kronenknoten von CYP76AK1 (die Divergenzzeit von Clade IV und anderen).

Syntenieblöcke zwischen jedem Paar von Kandidatenarten (N. cataria, S. rosmarinus, S. miltiorrhiza, S. bowleyana, S. hispanica und S. splendens) wurden mit MCScan (Python-Version) durchgeführt. Die gezielten CYP76AKs oder benachbarten Gene wurden als Samen für die Suche nach Syntenieblöcken der konservierten Evolution ausgewählt.

Unter Verwendung der übereinstimmenden Sequenzdatei, der phylogenetischen Baumdatei und der konfigurierten Kontrolldatei wurde das JTT + GAMMA-Modell des CodeML-Programms im PAML-Paket v4.986 verwendet, um die hypothetische Vorfahrensequenz von Mitgliedern der CYP76AK-Unterfamilie abzuschätzen. Die Regionen mit Ausrichtungslücken wurden mit der Parsimony-Methode analysiert, um die Basis der angestammten Reste zu bestimmen. Die geschätzten Vorfahrengene wurden dann zur funktionellen Identifizierung in S. cerevisiae synthetisiert und codonoptimiert.

Basierend auf den Stoffwechselergebnissen und der Literaturrecherche39 wurden die Artenzusammensetzungstypen von Salvia kodiert. Die Komponententypen sind in 6 Zustände codiert: keiner (A); TAs (B); 20-Keto-ATDs (C); TAs und 20-Keto-ATDs (D); CAs und 20-Keto-ATDs (E); TAs, CAs und 20-Keto-ATDs (F). Unter Verwendung des Evolutionsbaums (ML) mit Verzweigungslängeninformationen als Eingabebaum wurde die Statistical Dispersal-Vicarianance Analysis (S-DIVA) der Software Reconstruct Ancestral State in Phylogenies (RASP) verwendet, um Ahnenzustände von Komponententypen abzuleiten und phylogenetische Signale zu berechnen92.

Chemische Standards wurden von Shanghai Standard Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Die anderen Chemikalien und Reagenzien wurden wie folgt gekauft: Acetonitril und Methanol (HPLC-Qualität; Merck, Darmstadt, Deutschland), Warfarin (Sigma-Aldrich, Madrid, Spanien), Chloroform (Sinopharm Chemical Reagent, Shanghai, China), Leucin-Encephalin (Waters , Milford, MA, USA), reines destilliertes Wasser (Watsons Water, Hongkong, China) und Ameisensäure (HPLC-Qualität; Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, USA).

Jede Pflanze wurde in Wurzel- und Blattproben mit drei biologischen Replikaten aufgeteilt. Alle Proben wurden zu einem feinen Pulver gemahlen und 10 mg des vorbereiteten Pulvers wurden mit 1 ml 70 % Methanol (v/v), das Warfarin (5 μg/ml) als interne Referenz enthielt, 1 Stunde lang in einem Ultraschallbad (53 kHz) extrahiert , 350 W) bei 4 °C. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 12.000 × g und 4 ° C wurde der Überstand für die UHPLC-QTOF-MS-Analyse verwendet.

Für die Stoffwechselanalyse wurde ein Acquity UPLC-System (Waters, Milford, MA, USA) gekoppelt mit einem Xevo G2-XS QTOF-Massenspektrometer (Waters, Milford, MA, USA) verwendet. Die Proben wurden zunächst mit einer Acquity UPLC T3-Säule (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm) getrennt. Die Säulentemperatur wurde konstant bei 40 °C gehalten und die Flussrate betrug 0,40 ml/min bei einem Injektionsvolumen von 1,0 µL. Die mobilen Phasen für die Gradientenelution bestanden aus 0,1 % (v/v) Ameisensäure/Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 % (v/v) Ameisensäure/Acetonitril (Lösungsmittel B). Die Elutionsgradienten betrugen 98–80 % A über 0–7 Minuten, 80–78 % A über 7–11 Minuten, 78–40 % A über 11–20 Minuten, 40–35 % A über 20–25 Minuten, 25–40 % A über 11–20 Minuten. 28 Min. bei 35 % A, 35–5 % A über 28–30 Min., 30–33 Min. bei 5 % A und abschließende Wiederherstellung des Gleichgewichts bei 98 % A für 5 Min.

Zur Erfassung der MS-Daten wurde ein Xevo G2-XS mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle verwendet. MS wurde sowohl im Positiv-Ionen- als auch im Negativ-Ionen-Modus unter einer Kegelspannung von 30 V und einer Kapillarspannung von 3,0 kV (Positiv-Ionen-Modus) oder 2,5 kV (Negativ-Ionen-Modus) durchgeführt. Die Desolvatisierungstemperatur wurde auf 450 °C mit einer Desolvatisierungsgasströmungsrate von 600 l/h eingestellt, und die Quellentemperatur wurde auf 150 °C mit einer Kegelgasströmungsrate von 50 l/h eingestellt. Alle Daten wurden im MSE-Modus mit den folgenden Parametern erfasst: MSE-Bereich: 50–1200 m/z; MSE niedrige Energie, 6 eV; und MSE hohe Energie, 15–30 eV. Zur Kalibrierung des Instruments wurde eine Natriumformiatlösung (0,5 mM) verwendet. Als externer Standard zur Massenkorrektur wurde die kontinuierliche Erfassung von Leucin-Enkephalin verwendet. Alle Daten wurden in MassLynx v4.2 (Waters, Milford, MA, USA) angezeigt.

Die Rohdaten wurden zunächst in das Analysebasisdateiformat (ABF Converter; https://www.reifycs.com/AbfConverter/) konvertiert, bevor sie in die Software MS-DIAL v4.6093 importiert wurden. Die Parametereinstellungen waren wie folgt: Die Toleranzen für MS1 und MS2 betrugen 0,01 Da bzw. 0,02 Da. Der Massenbereich von MS1 ​​und MS/MS wurde zwischen 100 und 1000 eingestellt, wobei der MS/MS-Amplitudengrenzwert bei 800 lag. Der Retentionszeitbereich wurde zwischen 1,0 und 29,5 Minuten mit einer Retentionszeittoleranz von 0,15 Minuten eingestellt. Die Breite der Massenschicht betrug 0,1 Da. Addukttypen wie [MH]−, [M + HCOO]−, [M+Na-2H]−, [M + K-2H]−, [2M-H]− und [2 M + FA-H] − wurden für den Negativ-Ionen-Modus ausgewählt. [M + H]+, [M+Na]+, [M + K]+, [M + NH4]+ und [2 M + H]+ wurden für den Positivionenmodus ausgewählt. Jede der erhaltenen Merkmalstabellen wurde basierend auf den Retentionszeitbereichen in zwei Peaktabellen aufgeteilt, die dem Akkumulationsniveau der Phenolsäuren (1,0–18,5 min für Wurzel- und Blattproben) und den ATDs (16,5–29,5 min für Wurzelproben) entsprachen Proben; 14,0–29,5 Min. für Blattproben). Normalisierte Metabolomics-Daten wurden in SIMCA-P 14.1 (Umetrics AB, Umea, Schweden) importiert, um die chemometrische Analyse durchzuführen.

Basierend auf den Genom- und Transkriptomsequenzierungsdaten wurden alle CYP76AK-Kandidatengene identifiziert und unter Verwendung der in den Zusatzdaten 12 gezeigten Primer kloniert. Die offenen Leserahmen wurden unter Verwendung der Restriktionsstellen EcoR I und Not I weiter in den Epitop-markierten Vektor pESC-His subkloniert zur Expression im Hefestamm WAT11, der die NADPH-CYP-Reduktase ATR194 von A. thaliana enthält. Als Kontrolle wurde mit leerem pESC-His transformiertes WAT11 verwendet. Transformanten wurden auf SD-Dropout-Medium (-His) kultiviert und 72 Stunden lang bei 28 °C gezüchtet. Eine einzelne positive Kolonie wurde zunächst in 5 ml flüssigem SD-His-Medium etwa 24 Stunden lang bei 28 °C in einem Schüttelinkubator (200 U/min) gezüchtet. Anschließend wurde die Kultur zum Animpfen von 250 ml frischem SD-His-Flüssigmedium für weitere 24 Stunden bei 28 °C unter Schütteln verwendet. Anschließend wurden die Zellen gesammelt und dreimal mit sterilem Wasser und Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium mit 2 % Galactose (YPL) gewaschen. Die Zellen wurden dann mit YPL unter Schütteln für 16 Stunden bei 28 °C induziert. Tris-EDTA-Pufferlösung wurde mit 50 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA bei pH 7,4 hergestellt. Die Zellen wurden gewonnen und durch 5-minütige Zentrifugation bei 7000 × g in ein 50-ml-Röhrchen überführt und in 25 ml TEK-Puffer (0, 1 M KCl in TE-Puffer) resuspendiert. Die Zellen wurden dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen und erneut gewonnen und in vorgekühltem TESB (0,6 M Sorbitol in TE) resuspendiert. Alle Schritte wurden dann bei 4 °C durchgeführt. Die Zellen wurden bei 4–6 °C mit einem Niedrigtemperatur-Ultrahochdruck-Zellaufschlussgerät mit kontinuierlichem Durchfluss lysiert. Der Vorgang wurde dreimal wiederholt. Das Röhrchen wurde dann 30 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert und der Überstand in Röhrchen mit 10 ml Polyethylenglykol (PEG)-NaCl (PEG4000 und 0,15 M NaCl) überführt. Das Röhrchen wurde erneut 30 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in TEG-Puffer (5 % [v/v] Glycerin in TE-Puffer) resuspendiert.

Aktivitätstests wurden in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen unter Verwendung von 500 μl TE-Puffer (pH 7,5) durchgeführt, der 0,5 mg mikrosomale Gesamtproteine, 300 μM NADPH, 50 μM Substrat und ein Regenerationssystem (2,5 μM FAD, 2,5 μM FMN, 1 mM DTT, 2 mM Glucose-6-phosphat und 2 U Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase). Die Reaktionsmischungen wurden 16 Stunden lang bei 28 °C in einem Schüttelinkubator (200 U/min) inkubiert und anschließend dreimal mit 500 μl Ethylacetat unter Vortexen extrahiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 12.000 × g wurde die organische Phase in frische Mikroröhrchen überführt, unter Vakuum konzentriert und zur LC-MS-Analyse in 200 μl Methanol resuspendiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Arbeit stützen, sind im Papier und in den ergänzenden Informationsdateien verfügbar. Eine Berichtszusammenfassung für diesen Artikel ist als ergänzende Informationsdatei verfügbar. Die im Rahmen dieser Studie generierten und analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Alle an dieser Studie beteiligten Massenspektrometriedaten wurden in der National Omics Data Encyclopedia unter der Projekt-ID: OEP004258 hinterlegt. Die an dieser Studie beteiligten Transkriptomdaten wurden in der Genome Sequence Archive-Datenbank (CRA010533) hinterlegt, die unter https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa öffentlich zugänglich ist. HMM-Dateien von Pfam wurden verwendet, um CYP450 (PF00067)-Genfamilien vorherzusagen. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Autoren danken Dr. David Nelson (The University of Tennessee Health Science Center) vom P450-Nomenklaturausschuss für die Benennung der P450. Wir danken Herrn Jun Zhang von Kunming Plant Classification Biotechnology Co., Ltd. für die Sammlung und Identifizierung der Arten. Wir danken auch Dr. Pan Liao von der Hong Kong Baptist University für wertvolle Ratschläge zum Manuskript. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt vom National Key R&D Program of China (2022YFC3501700), der National Natural Science Foundation of China (31970325, 32070327), dem Young Elite Scientists Sponsorship Program by Cast (2021-QNRC1-02) und dem Research Project of Science and Technologiekommission der Stadt Shanghai (21DZ2202300).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jiadong Hu, Shi Qiu, Feiyan Wang, Qing Li.

Das SATCM-Schlüssellabor für neue Ressourcen und Qualitätsbewertung der chinesischen Medizin, Institut für chinesische Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, 201203, China

Jiadong Hu, Shi Qiu, Feiyan Wang, Ziding Wu, Rui Jiang, Jinxing Li, Zhen Zeng, Jing Wang, Xingxing Wang, Yuchen Zhang, Shiyuan Fang, Yuqi Qiao, Junfeng Chen und Wansheng Chen

Abteilung für Pharmazie, Zweites angegliedertes Krankenhaus der Navy Medical University, Shanghai, 200003, China

Jiadong Hu, Qing Li und Wansheng Chen

CAS Key Laboratory for Plant Diversity and Biogeography of East Asia, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming, 650201, China

Chun-Lei Xiang

Staatliches lokales gemeinsames technisches Forschungszentrum für Ginseng-Züchtung und -Anwendung, College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun, 130118, China

Peng Di

Urban Horticulture Research and Extension Center, Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai, 201602, China

Jie Ding & Yun Jiang

College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin, 150040, China

Zhichao Xu

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WSC, JFC, SQ und JDH planten und gestalteten die Forschung. JDH, FYW, RJ, JXL, ZZ, SYF, YQQ, JD, YJ bereiteten das Pflanzenmaterial für die Sequenzierung und chemische Profilierung vor. C.-LX identifizierte alle Arten. ZCX, QL und PD führten die bioinformatischen Analysen durch. SQ und FYW analysierten die Stoffwechseldaten. JDHZDW, JW, XXW und YCZ führten Experimente durch. JDH, FYW, ZCX, QL, SQ, JFC und WSC interpretierten die Daten und beteiligten sich an der Diskussion. JDH, ZCX, SQ und JFC haben den Artikel geschrieben. Das WSC hat das Papier überarbeitet. Die Autoren JDH, SQ, FYW und QL haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Korrespondenz mit Shi Qiu, Zhichao Xu, Junfeng Chen oder Wansheng Chen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Benjamin Lichman und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Hu, J., Qiu, S., Wang, F. et al. Die funktionelle Divergenz von CYP76AKs prägt die Chemodiversität von Diterpenoiden vom Abietan-Typ in der Gattung Salvia. Nat Commun 14, 4696 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40401-y

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Eingegangen: 20. Januar 2023

Angenommen: 26. Juli 2023

Veröffentlicht: 04. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40401-y

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